Honokiol induziert Apoptose

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 287 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Cryptocaryon irritans, ein häufiger Parasit in tropischen und subtropischen Meeresknochenfischen, hat der Meeresaquakulturindustrie ernsthaften Schaden zugefügt. In unserer vorherigen Studie wurde nachgewiesen, dass Honokiol die Schrumpfung und den Tod des Zytoplasmas von C. irritans tomont induziert, der Wirkmechanismus ist jedoch noch unbekannt.

In dieser Studie wurden die Veränderungen der apoptotischen Morphologie und des apoptotischen Verhältnisses durch mikroskopische Beobachtung und AnnexinV-FITC/PI-Färbung nachgewiesen. Die Auswirkungen von Honokiol auf die intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i), das Mitochondrienmembranpotential (ΔΨm), die reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Menge der DNA-Fragmentierungen (QDF) und die Caspase-Aktivitäten wurden durch Fluo-3-Färbung, JC-1, nachgewiesen Färbung, DCFH-DA-Färbung, Tunel-Methode und Caspase-Aktivitäts-Assay-Kit. Die Auswirkungen von Honokiol auf die mRNA-Expressionsniveaus von 61 Apoptose-bezogenen Genen in Tomonts von C. irritans wurden durch Echtzeit-PCR nachgewiesen.

Die Ergebnisse der Studie zu den Auswirkungen der Honokiol-Konzentration auf den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont zeigten, dass die höchsten Werte der Prophase-Apoptose-ähnlichen Todesrate (PADR), der [Ca2+]i-Konzentration, der ROS und der Aktivitäten von Caspase-3 /9 und das niedrigste Nekroseverhältnis (NER) wurden bei einer Konzentration von 1 μg/ml erhalten, die als am geeignetsten für die Auslösung des apoptoseähnlichen Todes von C. irritans tomont angesehen wurde. Als C. irritans tomonts mit 1 μg/ml Honokiol behandelt wurde, begann die [Ca2+]i-Konzentration nach 1 Stunde signifikant anzusteigen. Anschließend begannen ROS, QDF und die Aktivitäten von Caspase-3/9 signifikant anzusteigen, und ΔΨm begann nach 2 Stunden signifikant abzunehmen; Der höchste PADR wurde nach 4 Stunden erreicht. Die mRNA-Expression von 14 Genen wurde während der Honokiol-Behandlung signifikant hochreguliert. Von diesen Genen wurden itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 und fos im Signalweg angereichert, der mit der durch Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) induzierten Apoptose zusammenhängt.

Dieser Artikel zeigt, dass Honokiol einen apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont auslösen kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Honokiol die [Ca2+]i-Homöostase im ER stören und dann durch die Caspase-Kaskade oder den mitochondrialen Weg einen C. irritans-tomont-Apoptose-ähnlichen Tod induzieren kann, was eine neuartige therapeutische Intervention bei C. irritans-Infektionen darstellen könnte.

Cryptocaryon irritans, ein häufiger einzelliger Parasit mariner Knochenfische, verursacht die „Weißpünktchenkrankheit“ [1]. Diese Krankheit kommt vor allem in tropischen und subtropischen Meeresgebieten vor [2,3,4]. Sein Lebenszyklus umfasst vier Phasen: Trofont, Protomont, Tomont und Theront [5]. Tomont ist das am längsten andauernde, freilebende Stadium von C. irritans. Tomonts haben aufgrund ihrer harten Zysten eine starke Resistenz gegen Medikamente und raue Umgebungen. Tomonts können auch nach dreimonatiger Lagerung bei 12 °C noch infektiöse Theronten produzieren [5]. Es ist schwierig, C. irritans tomonts in einer offenen Marikulturumgebung vollständig zu entfernen, was die Vorbeugung und Bekämpfung der Weißpünktchenkrankheit sehr schwierig macht. Es ist eine gute Strategie, Parasiten vorzubeugen und zu behandeln, indem man ihren spontanen Tod herbeiführt. Dies hat den Vorteil, dass die Wahrscheinlichkeit einer Arzneimittelresistenz und einer Wirtsentzündung gering ist. Es ist bekannt, dass Apoptose ein stark regulierter Prozess des Zelltods ist [6]. In den letzten Jahren hat Apoptose eine neue Behandlung für viele Krankheiten wie Entzündungen, Krebs, Leishmaniose, Malaria und Toxoplasmose bereitgestellt [7,8,9,10,11,12,13,14]. Der Apoptose-ähnliche Todesweg wurde auch bei vielen Protozoen gefunden, wie z. B. Leishmania, Plasmodium falciparum, Tetrahymena thermophila, Trypanosoma cruzi, Blastocystis hominis, Toxoplasma gondii und Ichthyophthirius multifiliis [12,13,14,15,16,17,18]. ,19,20,21] und bietet damit eine neue Möglichkeit zur Behandlung parasitärer Krankheiten. Viele Apoptose-bezogene Gene von C. irritans wurden mittels Transkriptomanalyse gefunden [22,23,24,25,26], was darauf hindeutet, dass C. irritans einen apoptoseähnlichen Todesweg haben könnte. Es wurde berichtet, dass Honokiol, einer der Hauptwirkstoffe von Magnolia officinalis, über den Stressweg des endoplasmatischen Retikulums (ER) die Apoptose von Krebszellen und Candida albicans induziert [27,28,29,30]. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass Honokiol die Proliferation und das Schlüpfen von C. irritans tomonts signifikant hemmt. Das resultierende C. irritans tomont-Zytoplasma schrumpfte offensichtlich ohne Zytoplasma- oder Zellmembranschäden [31], was darauf hindeutet, dass Honokiol einen apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont auslösen könnte. Allerdings sind weitere Experimente erforderlich, um diese Spekulation zu bestätigen, und der Mechanismus muss noch aufgeklärt werden.

In diesem Artikel wurde die Annexin V-FITC/PI-Färbung verwendet, um zu bestimmen, ob Honokiol den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont induziert. Die Auswirkungen von Honokiol bei verschiedenen Behandlungskonzentrationen und -zeiten auf die Morphologien, die normale Rate (NOR), die Prophase-Apoptose-ähnliche Sterberate (PADR), die Anaphase-Apoptose-ähnliche Sterberate (AADR), die Nekroserate (NER) und die intrazelluläre Calciumkonzentration ( [Ca2+]i-Konzentration), Mitochondrienmembranpotential (ΔΨm), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Menge an DNA-Fragmentierungen (QDF), Caspase-Aktivitäten und mRNA-Expression von Apoptose-bezogenen Genen von C. irritans tomont wurden untersucht, um das aufzudecken Mechanismus von Honokiol zur Auslösung des apoptoseähnlichen Todes durch C. irritans tomont.

Trachinotus ovatus mit einem Gewicht von 80,0 ± 10,6 g wurde aus einer Meereskäfigkultur im Kreis Lingshui, Provinz Hainan, VR China, gekauft. Die Fische wurden 10 Minuten lang in Meerwasser mit 1 ml/l Formaldehyd eingeweicht und 21 Tage lang in 2000-l-Aquarien (Durchmesser = 2 m, Höhe = 1 m) akklimatisiert, die mit Belüftern und einem Durchflusswassersystem ausgestattet waren (Wassertiefe 0,6 m). , Wassertemperatur 29,0 ± 2,0 ℃, pH 7,8 ± 0,2, Salzgehalt 30 ± 0,5, gelöster Sauerstoff [DO] 6,8 ± 0,1 mg/l). Den Fischen wurde dreimal täglich (9:00, 16:00 und 22:00 Uhr) Meeresfischfutter (Zhongshan President Enterprises Co., Ltd., VR China) mit 4 % Körpergewicht gefüttert.

Honokiol mit einer Reinheit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) von ≥ 98 % wurde von Century Aoke Biological Technology Co., Ltd. (Volksrepublik China) bezogen. Eine Menge von 250 mg Honokiol wurde in 25 ml 50 % (v/v) wässriger Ethanollösung gelöst und auf 800, 400, 200, 100, 60 und 0 (Kontrollprobe) μg/ml mit 50 % (v/v) verdünnt. v) wässrige Ethanollösung.

Die in dieser Studie verwendeten Cryptocaryon irritans wurden aus T. ovatus mit Weißpünktchenkrankheit isoliert, aus einer Meereskäfigkultur im Kreis Lingao, Provinz Hainan, VR China, gewonnen und in T. ovatus passagiert und vermehrt [31]. Alle in dieser Studie verwendeten C. irritans tomonts wurden zwischen 8:00 und 9:00 Uhr am Tag des Experiments neu gesammelt.

Cryptocaryon irritans tomonts wurden gesammelt, in 1 ml filtersterilisiertem Meerwasser resuspendiert und in die zugewiesenen Vertiefungen einer Mikroplatte mit 24 Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden 10 μl einer wässrigen Lösung von 0 (Kontrollprobe), 60, 100, 200, 400 und 800 μg/ml Honokiol 50 % (v/v) Ethanol in die zugewiesenen Vertiefungen der Mikroplatten mit 24 Vertiefungen gegeben. Die endgültigen Honokiol-Konzentrationen betrugen 0,0 (Kontrollprobe), 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 bzw. 8,0 μg/ml. Die 24-Well-Mikrotiterplatten wurden 8 Stunden lang bei 27 ± 0, 5 ° C in einen Lichtinkubator (GZX250E, Tianjin Taisite Instrument Co., Ltd., VR China) gestellt. Die Morphologien, NOR, PADR, AADR, NER, [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase-Aktivitäten der oben behandelten C. irritans tomonts wurden mithilfe einer direkten mikroskopischen Beobachtungsmethode, einem Annexin V-FITC/, analysiert. PI-Apoptose-Nachweiskit, ein Fluo-3 AM-Kalziumkonzentrations-Nachweiskit, ein Mitochondrienmembranpotential-Testkit, ein Testkit für reaktive Sauerstoffspezies, ein Apoptose-Testkit für terminale Desoxynukleotidyltransferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) und ein Caspase-3/ 8/9 Aktivitätsassay-Kit. Cryptocaryon irritans tomonts wurden gemäß den Ergebnissen der obigen Experimente 0, 1, 2, 4, 8 und 16 Stunden lang mit Honokiol in der optimalen Konzentration behandelt. Ihre Morphologien, NOR, PADR, AADR, NER, [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase-Aktivitäten wurden ebenfalls mit den gleichen Methoden wie oben erwähnt analysiert. Cryptocaryon irritans tomonts wurden mit Honokiol unter den Bedingungen mit der höchsten Apoptoserate von Tomonts gemäß den Ergebnissen der obigen Experimente behandelt, und dann wurde die Hemmungsrate des Tomonts-Schlüpfens gemäß der von Zhong et al. beschriebenen Methode beobachtet. [31]. Jede der Caspase-Aktivitätsanalyse und der Analyse der mRNA-Expression apoptosebezogener Gene zugeordnete Vertiefung enthielt 1000 C. irritans tomonts, während jede den anderen Analysen zugeordnete Vertiefung 100 C. irritans tomonts enthielt. Jede Analyse wurde fünfmal parallel durchgeführt.

NOR, PADR, AADR und NER von C. irritans tomonts wurden mit einem Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) analysiert. Die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ beschrieben, wurden zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und in 100 μl Bindungspuffer resuspendiert. Eine Lösung von 5 μl Annexin V-FITC wurde hinzugefügt und die Tomonts wurden 10 Minuten lang bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln inkubiert. Dann wurde eine Lösung von 5 μl PI hinzugefügt und die Tomonts wurden 5 Minuten lang bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln inkubiert, zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS gewaschen und auf Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen übertragen (jede Vertiefung enthielt a C. irritans tomont). Insgesamt 150 C. irritans tomonts wurden parallel mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) bei Ex/Em = 488/525 nm und Ex/Em = 488/630 nm analysiert Ihre Mikromorphologien wurden unter einem Fluoreszenzinversionsmikroskop (DMi8 + DFC7000T, Leica Microsystems, Deutschland) beobachtet. Vierquadranten-Apoptosediagramme wurden unter Verwendung einer logarithmisch transformierten Annexin V-FITC-Fluoreszenzintensität [LG (A Ex/Em = 488/525 nm)] als Abszissenachse und einer logarithmisch transformierten PI-Fluoreszenzintensität [LG (A Ex/Em =)] erstellt 488/630 nm)] als Ordinatenachse. Den vier zufolge wurden normale (im I-Quadranten), Prophase-Apoptose-ähnlicher Tod (im II-Quadranten), Anaphase-Apoptose-ähnlicher Tod (im III-Quadranten) und Nekrose (im IV-Quadranten) identifiziert -Quadranten-Apoptosediagramme und ihre Zahlen wurden aufgezeichnet [28]. Schließlich wurden die Prozentsätze der NOR-, PADR-, AADR-, NER- und C. irritans-Tomonts berechnet.

Die [Ca2+]i-Konzentrationen in C. irritans tomonts wurden unter Verwendung eines Fluo-3 AM-Kalziumkonzentrationsnachweiskits (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) bestimmt. Die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ beschrieben, wurden zweimal mit 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und in 200 μl Fluo-3 AM-Reaktionsmix (5 μmol/l) bei inkubiert 20 Min. bei 27 ± 0,5 ℃ im Dunkeln. Dann wurde 1 ml 1 % fötales Rinderserum-Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS, pH = 7,4, 0,01 mol/l) zugegeben und die Tomonts wurden 40 Minuten lang bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln inkubiert und zweimal mit 1 gewaschen ml 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäurepuffer (HEPES, pH = 7,4, 0,01 mol/l) und in 100 μl HEPES bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln für 10 Minuten resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) bei Ex/Em = 488/525 nm bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Gesamtfluoreszenzintensität pro 100 C. irritans tomonts ausgedrückt.

Das ΔΨm in C. irritans tomonts wurde unter Verwendung eines Mitochondrienmembranpotential-Assay-Kits mit JC-1 (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) bestimmt. Die C. irritans-Tomonts wurden als Positivkontrolle 20 Minuten lang mit Carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP, 10 μmol/l) behandelt. Die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ und mit CCCP beschrieben, wurden zweimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und 20 Minuten lang in 10 µg/ml JC-1-Reaktionsmischung inkubiert bei 27 ± 0,5 ℃ im Dunkeln, zweimal mit 1 ml JC-1-Pufferlösung (1 ×) gewaschen und in 100 μl JC-1-Bindungspuffer (1 ×) resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) bei Ex/Em = 490/530 nm und Ex/Em = 525/590 nm bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Rate des potenziellen Polymers der Mitochondrienmembran zu Monomer (Polymer/Monomer) pro 100 C. irritans tomonts ausgedrückt [32].

Die ROS-Anreicherung in C. irritans tomonts wurde mit einem Testkit für reaktive Sauerstoffspezies (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) bestimmt. Die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ beschrieben, wurden zweimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und in 200 μl 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA, 10 μmol/l) Reaktionsmischung bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln für 20 Minuten, zweimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und in 100 μl PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) resuspendiert. l). Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) bei Ex/Em = 488/525 nm bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Gesamtfluoreszenzintensität pro 100 C. irritans tomonts ausgedrückt.

Der QDF in C. irritans tomonts wurde mit einem TUNEL-Apoptose-Assay-Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) bestimmt. Die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ beschrieben, wurden zweimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur in 200 μl 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd fixiert min, dreimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen, mit 200 μl 0,01 % Triton-PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) in Eis für 2 min permeabilisiert, zweimal in 1 ml gewaschen PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) und in 100 μl TUNEL-Reaktionsmischung (1 ×) bei 27 ± 0,5 °C im Dunkeln für 60 Minuten inkubiert, zweimal in 1 ml PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen. l) und in 100 μl PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) bei Ex/Em = 550/590 nm bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Gesamtfluoreszenzintensität pro 100 C. irritans tomonts ausgedrückt.

Die Aktivitäten von Caspasen, einschließlich Caspase-3/8/9 in den C. irritans tomonts, wurden jeweils mit einem Caspase-3/8/9-Aktivitätstestkit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., VR China) bestimmt. . Auf Eis wurden die C. irritans tomonts, behandelt wie in „Experimentdesign“ beschrieben, zweimal in 1 ml eiskaltem PBS (pH = 7,4, 0,01 mol/l) gewaschen, ein Lysepuffer wurde im Verhältnis 1 zugegeben: 10 (C. irritans tomonts Masse: Lysepuffer, g:ml), zur Homogenisierung auf Eis mit einem Mahlstab gemahlen, 15 Minuten in Eis gecrackt und zentrifugiert (15.000 g, 4 °C, 15 Minuten). Anschließend wurden die Überstände gesammelt. Die Überstände, Caspase-Reaktionspuffer und Substrate (Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilid zur Bestimmung der Caspase-3-Aktivität, N-Acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-Nitroanilid zur Bestimmung der Caspase-8-Aktivität, und Leu-Glu-His-Asp-p-Nitroanilid zur Bestimmung der Caspase-9-Aktivität) wurden zu Enzymplatten mit 96 Vertiefungen gegeben und 8 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, bestimmt mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc.). , USA) bei 405 nm. Die Aktivitäten von Caspase-3/8/9 wurden mit der folgenden Funktion berechnet:

wobei T ist die Reaktionszeit (h) und Cprotein ist die Gesamtproteinkonzentration im Überstand (mg/ml), bestimmt nach der Bradford-Methode [33].

Die C. irritans-Tomonts wurden mit Honokiol in der optimalen Konzentration behandelt, die gemäß den Ergebnissen des Versuchsdesigns für 0, 1, 2, 4, 8 und 16 Stunden und der mRNA-Expression der 61 Apoptose-bezogenen Gene durch Blasten erhalten wurde Das Genom von C. irritans (SRX12890364, SRX12890363) [34] wurde mit der RT-PCR-Methode analysiert. Jede der mRNA-Expression der Apoptose-bezogenen Genanalyse zugeordnete Vertiefung enthielt 1000 C. irritans tomonts. Jede Analyse wurde dreifach durchgeführt. Die 61 Apoptose-bezogenen Gene und ihre Primer, die von der Primer 3 plus-Software (https://www.primer3plus.com/) gemäß den Primer-Designregeln (70) entworfen wurden, sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. Die Spezifitäten der in dieser Studie verwendeten Primer wurden mit dem BLAST-Tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) bestätigt. Eastep Super Total RNA Extraction LS1040 (Promega Corp., USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um Gesamt-RNA mit dem Glasgewebehomogenisator aus den behandelten C. irritans tomonts zu extrahieren, und dazu wurde DNase I (Promega Corp., USA) verwendet verdauen die kontaminierende DNA. Anschließend wurden Agarosegelelektrophorese und ein Ultramikrospektrophotometer (NanoPhotometer NP80, IMPLEN GMBH, Deutschland) verwendet, um die Qualität der RNA sicherzustellen, und die cDNA-Sequenz wurde mit dem Eastep RT Master MIX Kit LS2054 (Promega Corp., USA) synthetisiert. Die mRNA-Expressionen wurden unter Verwendung des CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mit einem 10 μl Reaktionsgemisch, das 5 μl (2 ×) Eastep qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co., Ltd.) enthielt, nachgewiesen. , VR China), 1,0 μl cDNA-Template, 0,2 μl jedes Primers (10 μmol/l) und 3,6 μl nukleasefreies Wasser. Jede Probe wurde dreifach getestet. Die Echtzeit-PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 120 s anfängliche Denaturierung bei 95 °C, 40 Zyklen mit 15 s dauernder Denaturierung bei 95 °C und 60 s Glühen/Verlängern bei 60 °C. Um die Amplifikation eines einzelnen Produkts zu überprüfen, wurde eine Dissoziationskurvenanalyse (65 bis 95 °C: 0,5 °C-Schritte für 5 s) durchgeführt. Als internes Referenzgen wurde die 18S-rRNA-Gensequenz von C. irritans (JN636814.1) verwendet. Darüber hinaus wurden die Spezifitäten der Primer durch die quantitative Fluoreszenzschmelzkurve unter Verwendung des CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bestätigt. Nach der Echtzeit-PCR wurde die mRNA-Expression der Apoptose-bezogenen Gene mit der Methode von 2−△△Ct berechnet.

Alle experimentellen Indizes wurden mithilfe des Tukey-Tests mit SPSS 25.0 (IBM Corp., USA) getestet, um den signifikanten Unterschied zwischen der experimentellen Probe und der Kontrollprobe zu bestimmen. Ein Unterschied wurde als signifikant angesehen, wenn die p-Werte < 0,05 waren, und als äußerst signifikant, wenn die p-Werte < 0,01 waren. Das Diagramm wurde mit OriginPro 9.0 (OriginLab Corp., USA) erstellt und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt.

Die Morphologien der ungefärbten und AnnexinV-FITC/PI-gefärbten C. irritans tomonts, die mit Honokiol behandelt wurden, sind in Abb. 1 dargestellt, was zeigt, dass alle Zytoplasmen aller mit Honokiol behandelten C. irritans tomonts offensichtlich schrumpften und ihre Zellmembranen von Zysten getrennt waren und sie wurden dosisabhängig mit Annexin V-FITC (zeigt grüne Fluoreszenz) angefärbt; Dies weist auf einen Phosphatidylserin-Valgus in der Zellmembran hin (ein typisches Merkmal der Zellapoptose). Wenn die Honokiol-Konzentration > 4,0 μg/ml betrug, verdichteten sich die Zytoplasmen der behandelten C. irritans tomonts unregelmäßig, wurden hyaline und zeigten eine PI-Färbung (mit roter Fluoreszenz), was darauf hindeutet, dass ihre Zellmembranen beschädigt waren (ein typisches Merkmal von). Zellapoptose oder -nekrose im mittleren und späten Stadium). In Abb. 2 sind Vierquadranten-Apoptosediagramme dargestellt, die zeigen, dass mit dem Anstieg von Honokiol der PADR bei einer Konzentration von 0,6 μg/ml zu steigen begann. Es erreichte seinen höchsten Wert, als die Honokiol-Konzentration 1,0 μg/ml betrug, und nahm dann ab, während AADR und NER bei einer Konzentration von 2,0 μg/ml zu steigen begannen.

Morphologien von mit Honokiol behandelten Cryptocaryon irritans tomonts, gefärbt und ungefärbt mit Annexin V-FITC/PI. Die C. irritans-Tomonts wurden 8 Stunden lang mit Honokiol in einer Konzentration von 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml behandelt. Die behandelten Tomaten wurden mit Annexin V-FITC und einer PI-Sonde inkubiert und unter einem Fluoreszenzinversionsmikroskop (DMi8 + DFC7000T, Leica Microsystems, Deutschland) beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass das Zytoplasma aller mit Honokiol behandelten C. irritans tomonts offensichtlich schrumpfte und mit Annexin V-FITC angefärbt wurde. Wenn die Honokiol-Konzentration > 4,0 μg/ml betrug, waren die Zytoplasmen der behandelten C. irritans tomonts unregelmäßig kondensiert, wurden hyalin und wurden durch PI angefärbt. a–f: Morphologien von C. irritans tomonts, die jeweils 8 Stunden lang mit 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml Honokiol behandelt wurden. g–l: Morphologien von C. irritans tomonts, die jeweils 8 Stunden lang mit 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml Honokiol behandelt und bei Ex/Em = 488/525 nm beobachtet wurden. m–r: Morphologien von C. irritans tomonts, die jeweils 8 Stunden lang mit 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml Honokiol behandelt und bei Ex/Em = 488/630 nm beobachtet wurden. s–x: Überlappende Morphologiefotos von C. irritans tomonts, die jeweils 8 Stunden lang mit 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml Honokiol behandelt und bei Ex/Em = 488/525 nm und Ex/Em = aufgenommen wurden 488/630 nm. Alle Balken = 300 μm

Vierquadranten-Apoptosediagramme von Cryptocaryon irritans tomonts, die 8 Stunden lang mit Honokiol in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden. Die C. irritans-Tomonts wurden 8 Stunden lang mit Honokiol in einer Konzentration von 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml behandelt. Die behandelten Tomaten wurden mit Annexin V-FITC und einer PI-Sonde inkubiert und mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy H1, BioTek Instruments, Inc., USA) analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Erhöhung der Honokiol-Konzentration der PADR bei 0,6 μg/ml zu steigen begann und den höchsten Wert bei 1,0 μg/ml erreichte, während AADR und NER bei 2,0 μg/ml zu steigen begannen

Die [Ca2+]i-Konzentration und die ΔΨm-, ROS-, QDF- und Caspase-3/8/9-Aktivitäten in den C. irritans tomonts, die mit Honokiol in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden, sind in Abb. 3 dargestellt. Wie in Abb. 3A gezeigt, mit Durch den Anstieg der Honokiol-Konzentration stieg die [Ca2+]i-Konzentration auf einen Wert, der mit 0,6 μg/ml deutlich höher war als der der Kontrollprobe. Sie erreichte den höchsten Wert bei 1 μg/ml, kehrte mit 2,0 μg/ml auf den Wert der Kontrollprobe zurück und sank dann auf einen Wert ab, der deutlich unter dem der Kontrollprobe lag, als die Honokiol-Konzentration auf > 4,0 μg/ml anstieg. Wie in Abb. 3B gezeigt, sank der ΔΨm auf einen deutlich niedrigeren Wert als der der Kontrollprobe, wenn die Honokiol-Konzentration > 0,6 μg/ml betrug. Wie in Abb. 3C gezeigt, stieg der ROS mit der Erhöhung der Honokiol-Konzentration auf einen Wert an, der deutlich über dem der Kontrollprobe bei 1,0 μg/ml lag, und kehrte dann auf den Wert der Kontrollprobe zurück. Wie Abb. 3D zeigt, begann der QDF mit der Erhöhung der Honokiol-Konzentration bei 0,6 μg/ml anzusteigen, stieg auf einen deutlich höheren Wert als der der Kontrollprobe bei 1,0 μg/ml und erreichte den höchsten Wert bei 2,0 μg /ml und nahm dann ab, aber der Spiegel blieb deutlich höher als der der Kontrollprobe, als die Honokiol-Konzentration über 4,0 μg/ml anstieg. Wie in Abb. 3E gezeigt, begannen mit der Erhöhung der Honokiol-Konzentration beide Caspase-3/9-Aktivitäten auf deutlich höhere Werte als die der Kontrollprobe bei 0,6 μg/ml anzusteigen und erreichten die höchsten Werte bei 1,0 μg/ml. ml. Die Aktivität von Caspase-3 kehrte allmählich auf das Niveau der Kontrollprobe zurück, wenn die Honokiol-Konzentration ≥ 4,0 μg/ml betrug, während die Aktivität von Caspase-9 auf einem höheren Niveau blieb als das der Kontrollprobe und die Aktivität von Caspase -8 blieb immer auf dem Niveau der Kontrollprobe.

Auswirkungen der 8-stündigen Behandlung mit Honokiol in verschiedenen Konzentrationen auf die [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase-3/8/9-Aktivitäten in Cryptocaryon irritans tomonts. Die C. irritans-Tomonts wurden 8 Stunden lang mit Honokiol in einer Konzentration von 0,0, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml behandelt und die [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase-3/8/ Es wurden 9 Aktivitäten ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS und die Caspase-3/9-Aktivitäten alle die höchsten signifikanten Werte erreichten, wenn das Honokiol 1,0 μg/ml betrug, und dass der QDF den höchsten signifikanten Wert erreichte, wenn das Honokiol 1,0 μg/ml betrug 2,0 μg/ml. a Wirkung von Honokiol auf die [Ca2+]i-Konzentration in C. irritans tomonts. b Wirkung von Honokiol auf ΔΨm in C. irritans tomonts. c Wirkung von Honokiol auf ROS in C. irritans tomonts. d Wirkung von Honokiol auf QDF bei C. irritans tomonts. e Wirkung von Honokiol auf die Caspase-3/8/9-Aktivitäten in C. irritans tomonts. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD, n = 5 ausgedrückt. *Signifikanter Unterschied zur Kontrollprobe (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Hochsignifikanter Unterschied zur Kontrollprobe (0,0 μg/ml), P < 0,01

Die in „Wirkung von Honokiol auf [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase-3/8/9-Aktivitäten“ gefundenen Ergebnisse zeigten, dass C. irritans tomonts die höchste PADR, [Ca2+]i-Konzentration, ROS, Caspase-3/9-Aktivitäten und höhere QDF und die niedrigste NER, wenn die Honokiol-Konzentration 1,0 μg/ml betrug. Daher wurde 1,0 μg/ml als optimale Honokiol-Konzentration angesehen, um den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont auszulösen. Zusammen mit der Verlängerung der Behandlungszeit ergeben sich Veränderungen in der NOR-, PADR-, AADR-, NER-, [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und den Caspase-3/8/9-Aktivitäten für die C. irritans tomonts Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt und zeigen, dass mit der Verlängerung der Behandlungszeit die [Ca2+]i-Konzentration und PADR nach 1 Stunde signifikant anzusteigen begannen, gefolgt von ROS und QDF. Die Caspase-3/9-Aktivitäten begannen deutlich anzusteigen und ΔΨm begann nach 2 Stunden deutlich abzunehmen. Die [Ca2+]i-Konzentration, die PADR-, ROS-, QDF- und Caspase-3/9-Aktivitäten erreichten nach 4 Stunden die höchsten Werte und nahmen dann leicht ab, blieben aber auf deutlich höheren Werten als nach 0 Stunden, während ΔΨm bei weiter abnahm 16 Stunden, und der AADR begann nach 8 Stunden deutlich anzusteigen. Die NER und die Aktivität von Caspase-8 zeigten nach 16 Stunden keine signifikanten Veränderungen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die optimale Behandlungszeit für 1,0 μg/ml Honokiol, das den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomonts auslöst, 4 Stunden beträgt. Die Hemmungsrate des Tomont-Schlüpfens betrug 52,38 % nach 4-stündiger Behandlung mit 1,0 μg/ml Honokiol.

Einfluss der Honokiol-Behandlungszeit auf den apoptoseähnlichen Tod von Cryptocaryon irritans tomont. Die mit 1 μg/ml Honokiol behandelten C. irritans tomont bei 0, 1, 2, 4, 8 und 16 Stunden und ihre NOR-, PADR-, AADR-, NER-, [Ca2+]i-Konzentration, ΔΨm, ROS, QDF und Caspase -3/8/9 Aktivitäten wurden ermittelt. Das Ergebnis zeigt, dass die [Ca2+]i-Konzentration nach 1 Stunde signifikant anzusteigen begann, und dann begannen die ROS-, QDF- und Caspase-3/9-Aktivitäten signifikant anzusteigen und ΔΨm begann nach 2 Stunden signifikant zu sinken; Der höchste PADR wurde nach 4 Stunden erreicht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD, n = 5 ausgedrückt. *Signifikanter Unterschied zur Kontrollprobe (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Hochsignifikanter Unterschied zur Kontrollprobe (0,0 μg/ml), P < 0,01

Von den 61 untersuchten Apoptose-bezogenen Genen waren 14 signifikant hochreguliert (dargestellt in Abb. 5). Die quantitativen Fluoreszenzschmelzkurven der 14 Gene sind in der Zusatzdatei 2: Abb. S1 dargestellt. Unter den 14 hochregulierten Genen waren itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 und fos im Signalweg angereichert, der mit der Apoptose zusammenhängt, die durch die Störung der [Ca2+]-Homöostase in ER induziert wird. Unter den acht Genen war fos nach 4 Stunden signifikant hochreguliert, während die anderen Gene innerhalb von 2 Stunden signifikant hochreguliert waren. Das im Granzym-B-Weg angereicherte Gen gzmb war nach 16 Stunden deutlich hochreguliert, und das stromabwärts des Granzym-B-Weges angereicherte Gen tuba1c war nach 2 Stunden deutlich hochreguliert. Die am MAPK-Signalweg angereicherten Gene hras und raf1 waren nach 2 Stunden signifikant hochreguliert, und das Gen hras war nach 4 Stunden ebenfalls signifikant hochreguliert. Das im PI3K-Akt-Signalweg angereicherte Gen akt1 war nach 2 Stunden deutlich hochreguliert. Das Gen atm, der vorgeschaltete Regulator des p53-Signalwegs, war nach 2, 4 und 16 Stunden signifikant hochreguliert.

mRNA-Expression von Apoptose-bezogenen Genen in mit Honokiol behandelten Cryptocaryon irritans tomonts. Die mRNA-Expression der Apoptose-bezogenen Gene in C. irritans tomonts wurde jeweils nach 0, 1, 2, 4, 8 und 16 Stunden mit 1,0 μg/ml Honokiol behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass insgesamt 14 Gene zu unterschiedlichen Zeitpunkten signifikant zunahmen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD, n = 3 ausgedrückt. *Signifikanter Unterschied zur Kontrolle (0,0 μg/ml), P < 0,05. **Hochsignifikanter Unterschied zur Kontrolle (0,0 μg/ml), P < 0,01

Der Apoptose-ähnliche Todesweg wurde bei vielen Protozoen gefunden, wie z. B. Leishmania, P. falciparum, T. thermophila, T. cruzi, B. hominis, T. gondii und I. multifiliis [12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21]. Ichthyophthirius multifiliis ist der Erreger der Süßwasserfleckenkrankheit, dessen Morphologie und Lebenszyklus denen von C. irritans ähneln [1]. Es wurde berichtet, dass Fischhautantikörper Apoptose-ähnliche Phänomene wie PS-Externalisierung und Chromatinkondensation bei I. multifiliis verursachen können [16]. Es wurde auch berichtet, dass Malachitgrün Apoptose-ähnliche Phänomene wie bei I. multifiliis verursachen kann, wie z. B. Schwellung der Mitochondrien, Zerstörung der Integrität der Mitochondrienmembran, Änderung der Ribosomenzahl und PS-Externalisierung über den PI3K-Akt-Signalweg [21]. In dieser Studie wurde gezeigt, dass Honokiol eine signifikante Zytoplasmatrophie von C. irritans tomont, eine Verringerung des Zellvolumens, eine PS-Externalisierung, einen signifikanten Anstieg des QDF, der [Ca2+]i-Konzentration, der ROS- und Caspase-3/9-Aktivitäten sowie einen signifikanten Rückgang von ΔΨm verursacht und signifikante Hochregulierung der mRNA-Expression der 14 Apoptose-bezogenen Gene; Dies deutet stark darauf hin, dass es sich bei C. irritans tomonts um eine Form des regulierten Apoptose-ähnlichen Todes handelt. Der vom Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) genannte apoptoseähnliche Tod ähnelt der Apoptose von Metazoen [35] und gilt als ideale Strategie zur Vorbeugung und Behandlung parasitärer Krankheiten [11, 36]. Obwohl diese Studie bewiesen hat, dass es bei C. irritans tomonts zu einem apoptoseähnlichen Tod kommt, was einen potenziellen neuen Weg zur Behandlung der Weißpünktchenkrankheit bei Meeresfischen mit den Vorteilen einer geringeren Wahrscheinlichkeit von Arzneimittelresistenzen und Nebenwirkungen darstellt, sind weitere Studien erforderlich, um dies aufzudecken und bestätigen den Mechanismus, durch den Honokiol den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont auslöst.

Es wurde berichtet, dass Honokiol als einer der Hauptwirkstoffe von M. officinalis die Apoptose mehrerer Zellen induziert, wie z. B. Neuroblastomzellen, A549-Zellen, 95-D-Zellen und menschliche Chondrosarkomzellen, Pilze wie C. albicans und andere Protozoenparasiten wie Leishmania über den ER-Stressweg [8, 27,28,29,30, 36,37,38,39]. Der berichtete ER-Stressweg, der die Zellapoptose induziert, ist in Abb. 6 zusammengefasst, die zeigt, dass Medikamente wie Honokiol und physiologische oder Umweltfaktoren übermäßigen oder abweichenden ER-Stress verursachen können [30, 40, 41, 42]. Übermäßiger oder abweichender ER-Stress führt zur Ca2+-Freisetzung aus dem ER über den Inositol-1,4,5-trisphosphat-Rezeptor (IP3Rs) und zur Akkumulation der ungefalteten Proteinantwort (UPR) [43,44,45,46,47]. Cho et al. [48] ​​berichteten, dass Honokiol die [Ca2+]i-Freisetzung fördern und die [Ca2+]i-Konzentration erhöhen könnte, indem es die Aktivität des endoplasmatischen Retikulumproteins 44 (ERP44) hemmt, das eine hemmende Wirkung auf die Kalziumkanal-IP3Rs hat [49]. In ähnlicher Weise stieg in dieser Studie erstmals die [Ca2+]i-Konzentration bei C. irritans tomonts signifikant an. Der Anstieg von Ca2+ kann zwei bedeutende Reaktionen hervorrufen, Reaktion I und Reaktion II. In Reaktion I kann der Anstieg von Ca2+ die Kaskadenreaktion von Caspasen, einschließlich Calpainen, Caspase-12 und Caspase-3, auslösen [50,51,52]. Zeitgleich mit Reaktion I wurde die mRNA-Expression des für Calpain kodierenden Gens capn1 deutlich hochreguliert und die Aktivität von Caspase-3 in C. irritans tomonts deutlich erhöht. Mittels Sprengung im Genom von C. irritans wurde das Gen Caspase-12, das für Caspase-12 kodiert, nicht gefunden, wohl aber das Gen mc, das für Metacaspase kodiert, und dessen mRNA-Expression war ebenfalls deutlich hochreguliert. Es wurde berichtet, dass Metacaspase bei Protozoen wie Leishmania und Plasmodium eine Apoptose-Regulierungsfunktion hat, die Caspase-12 bei Metazoen ähnelt [11, 53, 54]. In Reaktion II kann der Anstieg von [Ca2+]i auch das ΔΨm der Mitochondrien verringern und dann die ROS-Produktion und -Freisetzung aus den Mitochondrien fördern [44, 55, 56]. Eine Erhöhung der ROS kann die [Ca2+]I-Freisetzung weiter fördern und QDF erhöhen, und dann aktivieren die Mitochondrien nacheinander Caspase-9 und Caspase-3 über den apoptotischen Protease-aktivierenden Faktor 1 (Apaf1) in Kombination mit Cytochrom c (CytC) [45, 57]. ]. In Übereinstimmung mit Reaktion II wurde nachgewiesen, dass Honokiol ΔΨm der Mitochondrien signifikant verringert und die ROS-Produktion, die Aktivitäten von Caspase-9 und Caspase-3 sowie QDF in C. irritans tomonts erhöht. Die aktivierte Caspase-3 kann Aktine und Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARPs) hydrolysieren und deaktivieren [58,59,60]. Aktine sind an der Aufrechterhaltung des Zytoskeletts beteiligt. Daher verursachen hydrolysierte Aktine eine Zytoplasmatrophie und eine Verringerung des Zellvolumens [61,62,63], während hydrolysierte PARPs irreversible DNA-Schäden und einen QDF-Anstieg verursachen [64,65,66]. Zur Unterstützung dieser Phänomene hat dieser Artikel bewiesen, dass Honokiol die mRNA-Expression der Gene actg1, actb und parp2, die jeweils Actine und PARPs kodieren, erheblich hochregulieren, C. irritans tomont-Zytoplasmatrophie und Zellvolumenverringerung verursachen und den QDF erhöhen kann [ 67,68,69]. Neben diesem Apoptoseweg, der durch ER-Stress über Ca2+ verursacht wird, führt der ER-Stress auch zur Akkumulation von UPR. Unter homöostatischen Bedingungen werden an der UPR beteiligte Proteine, die Proteinkinase RNA-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase (PERK), der aktivierende Transkriptionsfaktor 6 (ATF6) und das Inositol-erfordernde Enzym 1α (IRE1α) an das glukoseregulierte Protein 78 (GRP78) gebunden. durch ihre ER-Lumendomänen, wodurch sie inaktiv bleiben. Mit der Akkumulation von UPR, die dazu führt, dass GRP78 PERK, ATF6 und IRE1α verlässt, wird die Aktivierung dieser Proteine ​​induziert [45,46,47] (Abb. 6). Das aktivierte PERK aktiviert die Kaskadenreaktion, einschließlich der eukaryotischen Translation Initiation Factor 2-Untereinheit Alpha (eiF2α), des aktivierenden Transkriptionsfaktors 4 (ATF4) und des DNA Damage Inducible Transcript 3 (DDIT3). DDIT3 kann die Expression von Anti-Apoptose-Proteinen wie B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) verringern und die Expression von Pro-Apoptose-Proteinen wie Bcl-2, der mit dem Zelltod interagiert (Bim), erhöhen. Anschließend aktivieren die Mitochondrien nacheinander Caspase-9 und Caspase-3 über Apaf1 in Kombination mit CytC. Schließlich wird die Zellapoptose induziert [46]. Das aktivierte ATF6 aktiviert auch DDIT3 und induziert Apoptose über den Mitochondrienweg. Das aktivierte IRE1α aktiviert in Kombination mit dem TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor 2 (TRAF2) Kaskadenreaktionen, einschließlich der Apoptose-Signal-regulierenden Kinase 1 (ASK1) und der c-jun n-terminalen Kinase (JNKs). JNKs sind für die Phosphorylierung der mitochondrialen Proteine ​​Bim (Pro-Apoptose) und Bcl2 (Anti-Apoptose) verantwortlich, die aktiviert bzw. gehemmt werden. Anschließend induzieren die aktivierten JNKs den Apoptoseweg der Mitochondrien oder regulieren die Expression des Jun-Protoonkogens (c-jun) und des Fos-Protoonkogens (API) hoch, erhöhen den QDF und induzieren Zellapoptose [45,46,47]. Obwohl die mRNA-Expression von traf2 und fos in diesem Signalweg durch Honokiol signifikant hochreguliert wurde, zeigten die von eif2ak3, eif2s1, ern1, map3k5, mapk9 und mapk10 keine signifikanten Veränderungen, wenn C. irritans tomonts mit Honokiol behandelt wurde. Dies deutet darauf hin, dass Honokiol über diesen Weg möglicherweise nicht die Apoptose von C. irritans tomont induziert. Zusammenfassend legen die Ergebnisse dieser Studie nahe, dass Honokiol die Aktivität von ERP44 und die unbegrenzte IP3R-Freisetzung von [Ca2+]i hemmen, die [Ca2+]i-Homöostase im ER stören und dann den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont durch die Caspase-Kaskade induzieren könnte mitochondrialer Weg. Allerdings sind weitere Studien wie transkriptomische oder proteomische Analysen erforderlich, um diesen Vorschlag zu bestätigen.

Regulationsmechanismus der durch ER-Stress induzierten Apoptose. Diese Abbildung zeigt, dass der klassische ER-Stressweg die Zellapoptose induziert. Apaf1, Cytc, Fodrin, PERK, eiF2α, IRE1α, TRAF2, ASK1 und API wurden mit apaf1, cycs, sptan1, eif2ak3, eif2s1, ern1, traf2, map3k5 bzw. fos codiert. Beta-Actin und γ-Actin wurden jeweils mit actb und actg1 kodiert. Zu den Calpainen gehörten die katalytische Untereinheit Calpain-1 und die katalytische Untereinheit Calpain-2, die mit capn1 und capn2 kodiert wurden. PARPs umfassen Poly[ADP-Ribose]-Polymerase 2 und Poly[ADP-Ribose]-Polymerase 4, die mit parp2 und parp4 kodiert wurden. Zu den JNKs gehören die Mitogen-aktivierte Proteinkinase 9 und die Mitogen-aktivierte Proteinkinase 10, die jeweils mit Mapk9 und Mapk10 kodiert wurden. Zu den IP3Rs gehören der Inositol-1,4,5-trisphosphat-Rezeptor Typ 2 und der Inositol-1,4,5-trisphosphat-Rezeptor Typ 3, die jeweils mit itpr1, itpr2 und itpr3 kodiert wurden. Die mRNA-Expression von itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 und fos nahm in dieser Studie signifikant zu

Dieser Artikel zeigte, dass Honokiol den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont auslösen kann, und legte nahe, dass Honokiol die [Ca2+]i-Homöostase im ER stören und dann über die Caspase-Kaskade und den mitochondrialen Weg den apoptoseähnlichen Tod von C. irritans tomont induzieren kann. Dies könnte eine neuartige therapeutische Intervention bei C. irritans-Infektionen darstellen. Als nächstes geht es um die weitere Forschung zu sicherem und wirksamem Anti-C. Irritans-Medikamenten muss das intrazelluläre Ziel von Honokiol in C. irritans verifiziert werden.

Die Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel enthalten.

Kryptocaryon-Irritatoren

Endoplasmatisches Retikulum

Normaler Tarif

Prophase-Apoptose-ähnliche Sterblichkeitsrate

Anaphase-Apoptose-ähnliche Sterblichkeitsrate

Nekroserate

Intrazelluläre Calciumkonzentration

Mitochondriales Membranpotential

Reaktive Sauerstoffspezies

Menge der DNA-Fragmentierungen

Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptor

Entfaltete Proteinantwort

Endoplasmatisches Retikulumprotein 44

Apoptotischer Protease-aktivierender Faktor 1

Cytochrom c

Poly-ADP-Ribose-Polymerase

Proteinkinase RNA-ähnliche Kinase des endoplasmatischen Retikulums

Aktivierung des Transkriptionsfaktors 6

Inositol-benötigendes Enzym 1α

Glukosereguliertes Protein 78

Eukaryontischer Translationsinitiationsfaktor 2-Untereinheit Alpha

Aktivierung des Transkriptionsfaktors 4

Durch DNA-Schaden induzierbares Transkript 3

B-Zell-Lymphom 2

Mit Bcl-2 interagierender Mediator des Zelltods

TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor 2

Apoptose-Signal-regulierende Kinase 1

C-jun n-terminale Kinase

Jun-Protoonkogen

Fos-Protoonkogen

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Unzutreffend.

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31960739), dem National Key Research and Development Program of China (2021YFC2600600), dem Sonderfonds für Wissenschaft und Technologie der Provinz Hainan (ZDKJ2021016) und der Special Foundation of Agricultural and Rural Büro des Landkreises Lingao, Hainan, China (Nr. ZLHX2018-124R).

Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, Haikou, 570228, Volksrepublik China

Zi-Chen Zhao, Man-Yi Jiang, Ji-Hui Huang, Wei-Liang Guo, Zhi-Hong Zhong, Qing-Qin Huang, Shao-Long Liu, Heng-Wei Deng und Yong-Can Zhou

School of Life Sciences, Hainan University, Haikou, 570228, Volksrepublik China

Zi-Chen Zhao

Aquakulturabteilung, Hainan Agriculture School, Haikou, 571101, Volksrepublik China

Chuan Lin

Technologiezentrum des Zollbezirks Haikou, Haikou, 570105, Volksrepublik China

Ji-Hui Huang

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WLG und ZCZ haben die Konzeption und das Design dieser Studie abgeschlossen. ZCZ, MYJ, SLL und QQH haben die Experimente dieser Studie abgeschlossen. YCZ, WLG und ZCZ haben das Schreiben, Bearbeiten und Überprüfen dieses Artikels abgeschlossen. JHH, HWD, CL und ZHZ haben die Diskussion und Kommentare zu diesem Artikel abgeschlossen. YCZ und WLG waren insgesamt für diese Forschung verantwortlich.

Korrespondenz mit Wei-Liang Guo oder Yong-Can Zhou.

Das Experiment entsprach der achten Auflage des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 2011). Es wurde vom Institutional Animal Use and Care Committee der Hainan University (HNUAUCC-2020-00002) genehmigt.

Alle Autoren geben ihr Einverständnis zur Veröffentlichung.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Tabelle S1. Die 61 Apoptose-bezogenen Gene und ihre Primer, die in dieser Studie verwendet wurden.

Abb. S1. Die quantitativen Fluoreszenzschmelzkurven der 14 signifikant unterschiedlich exprimierten Gene.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, ZC., Jiang, MY., Huang, JH. et al. Honokiol löst bei Cryptocaryon irritans Tomont einen apoptoseähnlichen Tod aus. Parasites Vectors 16, 287 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05910-1

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Eingegangen: 26. Mai 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05910-1

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