NPM fördert Hepatotoxin

Cell Death & Disease Band 14, Artikelnummer: 575 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Leberfibrose wird durch eine Vielzahl chronischer Leberschäden verursacht und hat weltweit mit zunehmender Tendenz zu erheblicher Morbidität und Mortalität geführt. Die Aufklärung des molekularen Mechanismus der Leberfibrose ist die Grundlage für die Intervention in diesen pathologischen Prozess und die Entwicklung von Medikamenten. Nucleophosmin (NPM) ist ein weit verbreitetes nukleolares phosphoryliertes Protein, das besonders wichtig für die Zellproliferation, -differenzierung und das Überleben ist. Die biologische Rolle von NPM bei Leberfibrose ist weiterhin unbekannt. Hier zeigen wir, dass NPM die Leberfibrose auf mehreren Wegen fördert. Unsere Studie ergab, dass NPM in Zirrhosegeweben hochreguliert und in hepatischen Sternzellen (HSCs) aktiviert wurde. Die NPM-Hemmung reduzierte die Expression von Leberfibrosemarkern in HSCs und hemmte die Proliferation und Migration von HSCs. Im Mäusemodell kann der Abbau von NPM in HSCs oder die Anwendung eines spezifischen NPM-Inhibitors die Leberfibrose deutlich abschwächen. Die mechanistische Analyse zeigte, dass NPM die Leberfibrose fördert, indem es die Apoptose von HSCs über den Akt/ROS-Weg hemmt und TGF-β2 durch Akt-induziertes lncMIAT hochreguliert. LncMIAT regulierte die TGF-β2-mRNA durch kompetitives Schwämmen von miR-16-5p hoch. Als Reaktion auf eine Leberschädigung regulierten Hepatozyten, Kupffer-Zellen und HSCs NPM hoch, um die TGF-β2-Sekretion zu erhöhen und HSCs auf parakrine oder autokrine Weise zu aktivieren, was zu einer erhöhten Leberfibrose führte. Unsere Studie zeigte, dass NPM die Hepatotoxin-induzierte Fibrose durch Akt/ROS-induzierte Apoptose von HSCs und über den Akt/lncMIAT-hochregulierten TGF-β2 regulierte. Die Hemmung von NPM oder die Anwendung des NPM-Inhibitors CIGB300 schwächte die Leberfibrose deutlich ab. NPM dient als potenzieller neuer Angriffspunkt für Medikamente gegen Leberfibrose.

Hepatische Fibrose resultiert häufig aus mehreren Leberschäden und ist weltweit zu einer der Hauptursachen für leberbedingte Erkrankungen und Todesfälle geworden [1]. Eine wirksame Behandlung der Leberfibrose ist dringend erforderlich. Allerdings ist der Mechanismus der Fibrose noch nicht vollständig geklärt, was die Entwicklung von Medikamenten gegen Fibrose einschränkt. Bisher sind keine Medikamente gegen Fibrose zugelassen.

Leberfibrose betrifft eine Vielzahl von Zellen wie hepatische Sternzellen (HSCs), Hepatozyten, Makrophagen, Endothelzellen und Cholangiozyten. HSCs sind die Hauptauslöser der Fibrose [2, 3]. HSCs befinden sich im Zwischenraum zwischen Sinusendothel- und Leberepithelzellen und machen 5–8 % der Lebergewebezellen aus. HSCs sind in einer normalen, gesunden Leber inaktiv [4]. Als Reaktion auf eine Leberschädigung werden ruhende HSCs durch Entzündungsfaktoren oder anhaltenden oxidativen Stress aufgrund einer gestörten hepatischen Mikroumgebung aktiviert [5, 6]. Aktivierte HSCs weisen Proliferations- und Migrationseigenschaften auf und werden in Myofibroblasten-ähnliche Zellen umgewandelt [7], die große Mengen an Kollagen und extrazellulärer Matrix absondern und Leberfibrose verursachen. HSCs produzieren fast 90 % der extrazellulären Matrix und tragen maßgeblich zur Kollagenablagerung bei [8, 9].

Zu den Faktoren, die HSCs aktivieren, gehören der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor, der transformierende Wachstumsfaktor (TGF-β), der Tumornekrosefaktor und Interleukin (IL) [10]. Unter diesen Faktoren ist TGF-β1 ein starker fibrogener Faktor [11], der hauptsächlich von HSCs/Myofibroblasten, Kupffer-Zellen, Endothelzellen des Lebersinus und Hepatozyten synthetisiert wird [12]. Die Expression und Aktivität der drei TGF-β-Isoformen ist in verschiedenen Leberzellen unterschiedlich [13, 14], und die Daten zu β2- und β3-Isoformen bei fibrotischen Erkrankungen sind noch begrenzt. TGF-β2 und TGF-β3 können durch einen Integrin-unabhängigen Mechanismus mit einer niedrigeren Schwelle als TGF-β1 aktiviert werden, und die Hemmung von TGF-β2 und/oder TGF-β3 lindert fibrotische Erkrankungen [15, 16]. Über die Mechanismen, die TGF-β2 bei fibrotischen Erkrankungen regulieren, ist jedoch wenig bekannt.

Nucleophosmin (NPM), ein phosphoryliertes Nucleolus-Protein, wird häufig in proliferierenden Zellen exprimiert und ist an einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse beteiligt [17,18,19]. NPM fördert die Proliferation, Differenzierung und hemmt den programmierten Zelltod [20,21,22]. Die meisten bisher durchgeführten Studien haben die Deregulierung von NPM bei Krebserkrankungen untersucht und die hohe Expression von NPM ist mit der Tumorprogression verbunden [23, 24]. Über die Relevanz zwischen NPM und Leberfibrose wurde hingegen nicht berichtet.

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass NPM die Leberfibrogenese fördert, indem es die Akt/ROS-induzierte Apoptose von HSCs hemmt und Akt/MIAT-induziertes TGF-β2 in HSCs, Hepatozyten und Kupffer-Zellen hochreguliert. Darüber hinaus hemmt der NPM-Inhibitor das Fortschreiten der Leberfibrose bei Mäusen. Daher werfen unsere Ergebnisse ein weiteres Licht auf den molekularen Mechanismus der Leberfibrose und bieten ein potenzielles neues Medikamentenziel für Leberfibrose.

Alle Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Deklarationen von Helsinki und Istanbul durchgeführt und alle Protokolle wurden von der Ethikkommission für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Xiamen genehmigt. Alle Experimente und die Tierpflege wurden auf der Grundlage der im National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals dargelegten Richtlinien durchgeführt.

Fünf Wochen alte C57BL/6-Mäuse (männlich, Körpergewicht: 18–20 g) wurden vom Experimental Animal Center der Universität Xiamen bezogen. Für das TGF-β2-behandelte Mausmodell wurde das Experiment zusätzlich zu C57BL/6-Mäusen mit Balb/c-Mäusen wiederholt, die mehr HSCs enthalten und möglicherweise aussagekräftigere Ergebnisse zeigen. Leberfibrose wurde durch intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff (CCl4, 1 ml/kg Körpergewicht, verdünnt in Maisöl, alle 3 Tage) über 8 Wochen induziert. VA-gekoppelte Liposomen, die siRNAs (VA-lip-siRNAs) tragen, wurden in der fünften Woche nach der Verabreichung von CCl4 intravenös injiziert. Die siRNAs, die chemisch mit 2′-OMe und 5′-Chol modifiziert wurden, bestehen aus einer gleichen Mischung zweier siRNAs, die auf NPM-mRNA abzielen. Eine kleine Menge der zum Nachweis von Spuren verwendeten siRNAs wurde mit 5′-FAM chemisch modifiziert. Alle 3 Tage wurden etwa 0,7 mg/kg Körpergewicht siRNAs injiziert. CIGB300 [25] (10 mg/kg Körpergewicht, verdünnt in PBS, zweimal pro Woche) wurde in der fünften Woche intravenös injiziert. Den Mäusen der normalen und der Fibrose-Kontrollgruppe wurde das gleiche Volumen an Kochsalzlösung und Maisöl verabreicht. Die Mäuse jeder Gruppe wurden nach 8 Wochen getötet.

Die VA-lip-siRNAs, die auf HSCs abzielen, wurden wie zuvor beschrieben (26) mit einigen Modifikationen hergestellt. Dabei wurden die gefriergetrockneten leeren Liposomen (LipotrustTM EX Oligo, Lot-Nr. HH00301), die kationisches Lipid enthielten, durch Zugabe von bidestilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 mM hergestellt. Um VA-gekoppelte Liposomen herzustellen, die auf hepatische Sternzellen abzielen, haben wir 200 nmol Vitamin A (Retinol, Sigma), gelöst in DMSO, mit 100 µL Liposomensuspensionen (100 nmol als kationisches Lipid) durch Vortexmischen in einem 1,5-ml-Röhrchen bei 25 ° gemischt C. Ungefähr 15 µL siRNA-Gemisch (114,84 µg siRNAs in DDW) wurden unter Rühren bei 25 °C zur Retinol-gekoppelten Liposomenlösung gegeben. Das Verhältnis von siRNA zu kationischem Lipid betrug 1:11,5 (mol/mol) und das Verhältnis von siRNA zu Liposomen (Gew./Gew.) betrug 1:1. Jegliches freies Retinol oder siRNA wurde mit einem Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen (Amicon Ultra Concentrator 30.000 MWCO, Millipore) durch Zentrifugation bei 1500 × g und 25 °C entfernt. Das im Filter eingeschlossene Material wurde mit PBS rekonstituiert, um die gewünschte Dosis für die In-vivo-Verwendung zu erreichen.

Für die In-vivo-Verabreichung wurde MK2206 in einer Lösung gelöst, die 10 % DMSO, 40 % PEG300, 5 % Tween-80 und 45 % Kochsalzlösung enthielt, und Mäusen oral in einer Dosis von 240 mg/kg verabreicht. Die miR-16-5p-Mimetika und NC-Mimetika wurden mit der gleichen Methode wie der oben beschriebene VA-Lip-siNPM-Komplex zu VA-Lip-RNAs-Komplexen verarbeitet und dann Mäusen durch die Schwanzvene in einer Dosis von 0,7 mg/d injiziert. kg bzw.

Die Gewebearrays für das menschliche Lebererkrankungsspektrum (Lot-Nr. LV20812a und LV805c) wurden von US Biomax, Inc. bezogen. Die mit Paraformaldehyd fixierten Mauslebergewebe wurden dehydriert und in Paraffin eingebettet. Das Lebergewebe verschiedener Mäuse wurde in denselben Paraffinblöcken angeordnet und in Gewebearrays unterteilt. Diese Gewebearrays wurden mit herkömmlichem Hämatoxylin-Eosin oder Sirius-Rot gefärbt und unter einem Mikroskop fotografiert. Für die immunhistochemische (IHC) Analyse wurde der Gewebearray nach routinemäßiger Entparaffinierung und Antigenreparatur mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert, um endogene Peroxidase zu inaktivieren. Nach Blockierung mit 5 % BSA in PBS und Inkubation mit Antikörpern bei 4 °C über Nacht wurde am nächsten Tag das Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (MXB Biotech, Fujian) zugegeben und die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert . Zur Farbentwicklung wurde Diaminobenzidin verwendet. Nach der Farbreaktion wurde Hämatoxylin zum Kernfärben, Gradientenalkohol zur Dehydratisierung und Neutralharz zum Versiegeln der Folie verwendet.

Für die Fluoreszenz-Multiplex-IHC (mIHC)-Analyse wurde nach der Inkubation mit HRP-IgG das Fluorophor-konjugierte TSA®Plus-Amplifikationsreagenz zugegeben und die Mischung 10 Minuten lang inkubiert. Als Grundlage für die spezifischen Verfahren dienten die mIHC-Protokolle der CST Company. Der Schnitt wurde vor der Beobachtung mittels konfokaler Mikroskopie mit dem Antifade-Reagenz ProLong Gold versiegelt.

Primärzellen wurden mithilfe herkömmlicher Methoden aus Lebergewebe von Balb/c-Mäusen im Alter von 6–8 Monaten isoliert. Dabei wurden die Mäuse mit 10 % Chloralhydrat anästhesiert und für 5 s in 70 % Alkohol eingeweicht, und nach Fixierung der Gliedmaßen wurde der Bauch geöffnet. EGTA-Lösung, Collagenase P (Roche) und Pronase E (Roche)-Lösungen wurden nacheinander durch die Pfortader in die Leber injiziert. Nach der Perfusion wurde das Lebergewebe zerkleinert und zu einer Zellsuspension aufbereitet, und die Probe wurde 15 Minuten lang mit einer Enzymlösung (einschließlich Kollagenase P, Pronase E und DNase I) in einem Wasserbad bei 37 °C verdaut. Nach der Verdauung wurde die Zellsuspension durch einen 70-µm-Zellfilter geleitet und zentrifugiert (250 g, 10 Minuten), um den Zellniederschlag zu erhalten.

Zur primären HSC-Isolierung wurden die suspendierten Zellen bei einem Dichtegradienten mit 15 % und 35 % Percoll-Lösung zentrifugiert (900 g, 15 min, 4 °C). Die HSC-Schicht wurde gesammelt und in einer Zellkulturschale mit D10-Medium beimpft. Nach 2 Stunden wurde das Medium, das nicht anhaftende Zellen enthielt, entfernt und die verbleibenden anhaftenden Zellen wurden mit D10-Medium kultiviert. Die Zellreinheit wurde mithilfe der α-SMA-Immunfluoreszenzmethode identifiziert.

Zur primären Kupffer-Zellisolierung wurden die suspendierten Zellen bei einem Dichtegradienten mit 25 % und 50 % Percoll-Lösung zentrifugiert (500 g, 15 min, 4 °C). Die Kupffer-Zellschicht wurde gesammelt und in einer Zellkulturschale inokuliert. Nach 2 Stunden wurde das Medium, das nicht anhaftende Zellen enthielt, entfernt. Die Zellreinheit wurde mithilfe der F4/80-Immunfluoreszenzmethode identifiziert.

Das Lebergewebe einer Maus wurde mit einer chirurgischen Klinge in Gewebeblöcke von etwa 1 mm³ geschnitten. Die Gewebeblöcke wurden mit 30 ml vorgekühltem PBS gewaschen und 1 Minute lang bei 50 g zentrifugiert, um die roten Blutkörperchen im Überstand zu entfernen. Die Gewebeblöcke wurden mit 15 ml Verdauungslösung 30 Minuten lang bei 37 °C enzymolisiert, wobei von Zeit zu Zeit geschüttelt wurde. Die enzymatische Lösung wird mit DMEM hergestellt, das Typ-IV-Kollagenase (1 mg/ml), Streptomyces-Protease (1 mg/ml), DNase I (20 µg/ml) und 2 % FBS enthält. Die Einzelzellsuspension wurde nach der enzymatischen Hydrolyse durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 70 µm in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und vorgekühlte PBS-Lösung (mit 0,5 % EGTA) wurde zu 40 ml hinzugefügt, um die enzymatische Verdauung zu beenden. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten lang bei 4 °C und 800 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. 10 ml vorgekühlter ACK-Lysepuffer wurden zum Zellpräzipitat zur Suspension hinzugefügt, und zwei Minuten später wurden 40 ml vorgekühltes PBS hinzugefügt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen.

1 ml PBS wurde zum Zellniederschlag gegeben und vollständig zu einer Einzelzellsuspension (ca. 3 ml) suspendiert, die gleichmäßig in zwei Teile aufgeteilt wurde. Zellsuspension I wurde mit der ROS-Sonde DCFH-DA bis zu einer Endkonzentration von 5 µM versetzt und 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Während bei Zellsuspension I eine ROS-Markierung durchgeführt wurde, wurden hepatische Sternzellen isoliert und bei Zellsuspension II markiert. 1,5 ml Zellsuspension II wurden 2 Minuten lang bei 800 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Mit GBBS hergestellte 12 %ige Nykondens-Gradiententrennungslösung (Dichte etwa 1,055–1,080 g/ml) wurde der Zellfällung bis zu einem Volumen von 13 ml zugesetzt und vollständig zu einer Einzelzelllösung suspendiert. Etwa 2 ml D-Hanks (enthaltend 2 % FBS) wurden vorsichtig auf die obere Flüssigkeitsoberfläche entlang der Röhrchenwand gegeben. Zentrifuge mit horizontalem Rotor bei 1350 g für 10 Min. Zellen in der D-Hanks-Lösung und an der Grenzfläche der beiden Lösungen wurden gesammelt, mit dem fünffachen Volumen D-Hanks (enthaltend 2 % FBS) gewaschen, 5 Minuten bei 600 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Bei den oben aus der Zellsuspension II abgetrennten präzipitierten Zellen handelt es sich um HSCs, die mit dem Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime, Lot-Nr. C1062L) weiter markiert werden. Während der Markierung apoptotischer Zellen können mit ROS-Sonden markierte HSCs mit der oben beschriebenen Methode aus der Zellsuspension I abgetrennt werden. Der gesamte Prozess dauert etwa 110 Minuten, wodurch die Aktivität der Zellen und der physiologische Zustand in vivo weitestgehend erhalten bleiben. Die markierten und isolierten HSCs wurden mittels Durchflusszytometrie auf ROS bzw. Apoptose nachgewiesen.

Die menschliche HSC-Linie LX-2 wurde von der BeNa Culture Collection of China erhalten und von Genetic Testing Biotechnology Corporation (Suzhou, China) mithilfe kurzer Tandem-Repeat-Marker identifiziert. Die Ratten-HSC-Linie CSFC-2G wurde von Dr. Honghua Zheng von der Universität Xiamen gespendet. Die menschlichen Leberkrebszelllinien HepG2 und SK-HEP-1 sowie die menschliche embryonale Nieren-293-T-Zelllinie wurden von der Cell Bank of Shanghai Institutes for Biological Sciences of China bezogen. Diese Zelllinien wurden in DMEM (Gibco, Kat.-Nr. 12800-017) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (PAN, Kat.-Nr. ST30-3302) enthielt. Die THP-1-Zelllinie wurde in RPMI-1640-Medium (BasalMedia, Cat#L210K) kultiviert. Zu den an dieser Studie beteiligten Medikamenten gehören TGF-β1 (PeproTech, Kat.-Nr. 100-21-10), TGF-β2 (Novoprotein, Kat.-Nr. CJ79-50), NPM-Inhibitor CIGB300 (Royo Biotech, Shanghai), Akt-Phosphorylierungsinhibitor MK2206 und Aktivator SC79 (Selleck, Kat.-Nr. S1078, Kat.-Nr. S7863) und ROS-Inhibitor N-Acetylcystein (NAC) (Beyotime, Kat.-Nr. ST1546). TGF-β1 (10 ng/ml), TGF-β2 (10 ng/ml), CIGB300 (4 und 8 µM), MK2206 (4 und 8 µM), SC79 (4, 8 und 12 µM) und NAC ( 1 und 3 µM) wurden zur Zellbehandlung verwendet.

Das pCW-Cas9-Plasmid und pLX-sgRNA (Zielsequenz: GCAAGAATCCTTCAAGAAAC) wurden in Zellen co-transfiziert und die Expression von Cas9 wurde mit 2 µg/ml Doxycyclin nach 24-stündiger Kultur induziert. Puromycin in einer Menge von 1,5 µg/ml und Blasticidin S in einer Menge von 0,85 µg/ml wurden nach 24-stündiger Kultur hinzugefügt. Nach ein bis zweiwöchiger Kultur wurden resistente klonale Gemeinschaften beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt wurden monoklonale Zellen ausgewählt und für zwei Generationen subkultiviert, und eine ausreichende Anzahl von Zellen wurde für die Verifizierung mittels Western Blot und PCR gesammelt.

Die Sequenzen von siRNA, shRNA, sgRNA und Negativkontrolle sind in den Ergänzungstabellen S1 und S2 im Ergänzungsmaterial aufgeführt. Der shRNA-Vektor wurde unter Verwendung des Plasmids pLKO.1 konstruiert und als Lentivirus verpackt, um Zellen zu infizieren und die Genexpression zu unterdrücken. Der sgRNA-Vektor für die MIAT-Transkriptionsaktivierung wurde unter Verwendung des Plasmids lentiSAM v2 (Puro) konstruiert, das von Adam Karpf (Addgene-Plasmid #92062) bereitgestellt wurde.

Das Protein wurde auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen und die Membranen wurden mit dem Primärantikörper und dann mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Sekundärantikörper gegen IgG inkubiert. Die Membranen wurden mit ECL-Reagenz (Thermo Fisher) belichtet und mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem Azure 300 (Azure Biosystems, USA) analysiert. Die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt, und die Originalbilder des Western Blots sind in den Ergänzungsmaterialien enthalten.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol extrahiert und mithilfe des PrimeScript RT-Reagenzienkits mit gDNA Eraser (TaKaRa, Cat#:RR047A) revers in cDNA transkribiert. Anschließend wurde cDNA als Matrize für die PCR-Amplifikation auf dem ABI7500-Instrument unter Verwendung von ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Kat.-Nr. Q331-03) verwendet.

Die auf dem Objektträger ausgesäten Zellen oder die frisch gefrorenen Gewebeschnitte wurden anschließend mit Paraformaldehyd fixiert, mit Wasserstoffperoxid inaktiviert, mit Zitronensäurepuffer antigenisch repariert und mit Protease IV behandelt. Die Hybridisierung wurde mit der MIAT-Sonde (ACD, Kat.-Nr. 458501) durchgeführt und die Probe wurde mit TSA®Plus-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Für den dualen Markierungsprozess von RNA-in-situ-Nachweis und immunhistochemischer Färbung wurde nach der RNA-Hybridisierung eine Antikörperfärbung durchgeführt. Einzelheiten finden Sie im Benutzerhandbuch des RNAscope® Multiplex Fluorescent V2 (Kat.-Nr. 323100, Advanced Cell Diagnostics, Inc.).

Logarithmisch gewachsene Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 4000 Zellen in jeder Vertiefung und fünf Replikaten in jeder Gruppe ausgesät. Nachdem die Zellen vollständig an der Wand hafteten (6–10 Stunden), wurde der erste Zeitpunkt gemessen. In jede Vertiefung wurden etwa 10 µl CCK-8-Lösung (Beyotime, Shanghai) gegeben. Die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt.

CellROX Orange Reagent (Yeasen) wurde zur Markierung von intrazellulärem Wasserstoffperoxid (H2O2) und Dihydroethidium (Beyotime) zur Markierung von intrazellulärem Superoxidanion (O2-) verwendet. Die Fluoreszenzsonde wurde mit serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 5 mM verdünnt, in adhärente kultivierte Zellen gegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann in PBS resuspendiert. Die Zellfluoreszenz wurde durch Durchflusszytometrie mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm und einer Emissionswellenlänge von 620 nm nachgewiesen.

LX-2-Zellen wurden 12 Stunden lang in serumfreiem Medium ausgehungert und 6 Stunden lang mit CIGB300 in verschiedenen Konzentrationen (2, 4, 6, 8 und 10 µM) oder MK2206 (4 und 8 µM) stimuliert. CIGB300 wurde in PBS gelöst. MK2206 wurde in DMSO gelöst und in PBS verdünnt. Die Zellen in der/den Kontrollgruppe(n) wurden mit PBS oder verdünntem DMSO in PBS behandelt. Die Zellen wurden geerntet, und Annexin V-FITC und PI wurden hinzugefügt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Zellapoptose wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen.

Statistische Methoden wurden nicht verwendet, um die Stichprobengröße im Voraus zu bestimmen. Die Mäuse wurden zufällig in Versuchsgruppen eingeteilt. Die Injektion war nicht blind. Für Tiere gibt es keine Ausschlusskriterien. Für alle statistischen Analysen wurde Graphpad Prism 7.0 (GraphPad, San Diego, USA) verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die Varianz war zwischen den Gruppen, die statistisch verglichen wurden, ähnlich. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurde durch den Standard-T-Test bewertet, wenn die Varianz zwischen den Gruppen ähnlich ist. Die Signifikanz wurde bei einem P-Wert < 0,05 definiert. Alle Experimente wurden mindestens dreimal dreifach durchgeführt und repräsentative Daten werden angezeigt.

Unsere vorherige Studie zeigte, dass NPM in zirrhotischen Geweben von Ratten signifikant erhöht war, was darauf hindeutet, dass NPM an der Leberfibrose beteiligt sein könnte [27]. In der vorliegenden Studie wurde die Relevanz zwischen NPM und menschlicher Leberfibrose im Mikroarray von menschlichem Lebererkrankungsgewebe bestimmt. Die IHC-Färbung zeigte, dass NPM in entzündlichen und zirrhotischen Geweben hochreguliert ist (Abb. 1A), und die Phosphorylierung des NPM-Proteins bei Ser125 war in Leberparenchymzellen oder Nichtparenchymzellen (Abb. 1B) von Zirrhosegewebe signifikant hochreguliert , was darauf hindeutet, dass NPM mit dem Fortschreiten der menschlichen Leberfibrose zusammenhängt.

Die Ergebnisse einer IHC-Färbung zeigten einen signifikanten Anstieg des NPM-Proteins in der entzündlichen und fibrotischen Leber und im Leberkrebsgewebe von Gewebearrays aus dem Spektrum menschlicher Lebererkrankungen (LV20812a), darunter 32 Fälle von normalem Lebergewebe, 48 Fälle von Hepatitis und 72 Fälle von Leberentzündung Leberzirrhose und 48 Fälle von bösartigem Tumor. B Quantitative Analyseergebnisse des menschlichen Lebergewebe-Mikroarrays (LV805c) bestätigten, dass die NPM (Ser125)-Phosphorylierung in Leberparenchym- und Nichtparenchymzellen im Zirrhosestadium signifikant erhöht war. Ein CA-Mausmodell der durch CCl4 induzierten Leberfibrose bestätigte, dass NPM während der Leberzirrhose deutlich anstieg. Hämatoxylin-Eosin (HE) und Sirius-Rot-Färbung von Lebergewebe deuteten auf signifikante, durch CCl4 induzierte Fibroseveränderungen im Lebergewebe hin (n = 5). Immunhistochemische Färbungen zeigten, dass NPM im Lebergewebe von mit CCl4 behandelten Mäusen deutlich anstieg. D Nach 24-stündigem Hungern in serumfreiem Medium wurde TGF-β1 zur 48-stündigen Stimulierung von LX-2-Zellen verwendet, und der Western Blot zeigte eine erhöhte Proteinexpression von NPM und α-SMA. E Quantitative PCR zeigte, dass die α-SMA- und NPM-mRNAs nach der TGF-β1-Behandlung zunahmen. F Die isolierten primären Maus-HSCs wurden aktiviert und die Expression von NPM nahm während der Kultur zu. Die gezeigten Daten stellen das Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Expressionsdaten von WB oder qPCR wurden relativ anhand der Expressionsniveaus des β-Actin- oder α-Tubulin-Gens quantifiziert. Mittelwert ± SEM; *p < 0,1, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; t testen.

Bei Mäusen mit CCl4-induzierter Leberfibrose zeigten die HE- und Siriusrot-Färbung signifikante Fibroseveränderungen in der Leber (Abb. 1C). Bei Fibrose zeigten die IHC-Ergebnisse, dass der NPM im Lebergewebe deutlich anstieg. Daher besteht ein Zusammenhang zwischen NPM und Leberfibrose bei Mäusen, und NPM könnte am Fortschreiten der Leberfibrose beteiligt sein.

Da HSCs die Haupteffektorzellen der Leberfibrose sind und ihre Aktivierung und Kollagensekretion die zentralen Ereignisse der Leberfibrose sind, haben wir uns zunächst auf HSCs konzentriert und die Relevanz zwischen NPM-Expression und HSC-Aktivierung analysiert. Die TGF-β1-induzierte Aktivierung von HSC LX-2 ist ein weit verbreitetes Leberfibrose-Zellmodell. Western Blot und quantitative PCR-Analyse zeigten, dass beide Fibrosemarker α-SMA und NPM nach der Behandlung mit TGF-β1 dosisabhängig anstiegen (Abb. 1D, E). In Anbetracht der Tatsache, dass LX-2 ein aktiviertes HSC ist, untersuchten wir NPM-Änderungen in primär isolierten Maus-HSCs während der Aktivierung. Die WB-Ergebnisse zeigten, dass primäre HSCs während der Kultur allmählich aktiviert wurden und NPM mit der Zunahme von α-SMA und Kollagen I signifikant zunahm (Abb. 1F).

Um die Rolle von NPM bei der Aktivierung von HSCs zu bestimmen, wurden CRISPR-Cas9- und Small Interfering RNA (siRNA)-Techniken verwendet, um die Expression von NPM in menschlichen (LX-2) bzw. Ratten-HSCs (CSFC-2G) zum Schweigen zu bringen. Als das NPM in CSFC-2G- und LX-2-Zellen vollständig ausgeschaltet war, wurde die Expression der Fibrosemarker α-SMA, Kollagen I und MMP9 deutlich herunterreguliert (Abb. 2A, B). Der NPM-Knockdown durch siRNAs verringerte auch die Fibrosemarker in unterschiedlichem Maße (Abb. 2C, D). Das NPM-Protein wurde in primären Maus-HSCs, die 13 Tage lang kultiviert wurden, weiter abgebaut oder überexprimiert. Mit der Änderung des NPM nahmen auch die Leberfibrosemarker entsprechend ab oder zu, was darauf hindeutet, dass NPM den Spiegel der Leberfibrosemarker beeinflusst (Abb. 2E). Western-Blot-Ergebnisse zeigen, dass ein kleines Molekül CIGB300, das an NPM-Protein binden und die Phosphorylierung bei Ser125 hemmen konnte [25, 28], dosisabhängig α-SMA, Kollagen I und MMP9 in LX-2-Zellen hemmte (Abb. 2F). . Das α-SMA ist ein Marker für die Transdifferenzierung von HSCs in Myofibroblasten. Daher kann NPM die Transdifferenzierung von HSCs und die Kollagensynthese erheblich beeinflussen.

Ein Western-Blot-Ergebnis zeigte, dass die Expressionsniveaus von α-SMA, Kollagen I und MMP9 stark herunterreguliert wurden, wenn NPM in CSFC-2G- und LX-2-Zellen durch CRISPR-Cas9 ausgeschaltet wurde. B Quantitative PCR bestätigte die verringerte mRNA-Expression von α-SMA, Kollagen I und MMP9 in LX-2- und CSFG-2G-Zellen mit ausgeschaltetem NPM. Die Ergebnisse der C-Western-Blot-Analyse zeigten, dass der NPM-Knockdown durch siRNAs die Fibrosemarker, einschließlich α-SMA, Kollagen I und MMP9, in LX-2-Zellen verringerte. D Quantitative PCR bestätigte außerdem den NPM-Knockdown durch siRNAs und das reduzierte α-SMA, Kollagen I und MMP9. Das E-NPM-Protein wurde in primären hepatischen Sternzellen, die 13 Tage lang kultiviert wurden, abgebaut oder überexprimiert, und die Marker für Leberfibrose waren entsprechend verringert oder erhöht. F CIGB300, ein niedermolekularer Inhibitor der Ser125-Phosphorylierung des NPM-Proteins, regulierte α-SMA, Kollagen I und MMP9 in LX-2-Zellen herunter. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und die relative Quantifizierung von Daten basierend auf der β-Actin- oder α-Tubulin-Genexpression. n ≥ 3; Mittelwert ± SEM; **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; T-Test.

Proliferation und Migration sind wichtige Merkmale der HSC-Aktivierung. Dementsprechend untersuchten wir die Wirkung von NPM auf die Proliferation und Migration von HSCs. Die Ergebnisse des CCK-8-Proliferationstests zeigten, dass NPM-Knockout in CSFC-2G-Zellen (ergänzende SAbb. 1A) oder NPM-Knockdown in menschlichen LX-2-Zellen (SAbb. 1B) die Zellproliferation signifikant hemmten. Transwell- und Scratch-Assays zeigten, dass die NPM-Stummschaltung die Migration von CSFC-2G- (Abb. 1C) und LX-2-Zellen (Abb. 1D) signifikant hemmte.

Die mit Retinol beschichteten Liposomen können aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit zur Vitamin-A-Aufnahme effektiv auf HSCs für die siRNA-Abgabe abzielen. Die Anreicherungsprozentsätze der siRNA, die von Retinol-beschichteten Liposomen (VA-Lip-siRNA) in primären HSCs, Makrophagen und Hepatozyten getragen wird, betrugen 32,96 %, 1,65 % bzw. 0,21 %, was eine starke Spezifität für HSCs zeigt [26]. Um zu zeigen, dass NPM in HSCs die Fibrose beeinflusst, wurde der VA-Lip-siNPM-Komplex in die Schwanzvene von Mäusen mit CCl4-induzierter Leberfibrose injiziert, um NPM in HSCs auszuschalten (Abb. 3A). Um potenzielle Off-Target-Effekte zu reduzieren, wurde eine gleiche Mischung aus zwei auf NPM abzielenden siRNAs verwendet. Der Anreicherungseffekt von VA-Lip-siRNA in HSCs wurde unter Verwendung von FAM-markierter siRNA als Tracermolekül bewertet. Konfokalmikroskopische Beobachtungen zeigten, dass FAM-markierte siRNA hauptsächlich in der Portalregion angereichert war und eine signifikante Co-Lokalisierung mit α-SMA aufwies, was auf die spezifische Targeting-Wirkung von VA-Lip-siRNAs auf HSCs schließen lässt (Abb. 3A). Die Fluoreszenzanalyse zeigte, dass das NPM-Protein in HSCs durch siNPM deutlich herunterreguliert wurde (Abb. 3B). Die Western-Blot-Analyse von Mauslebergewebe zeigte, dass die Expression von α-SMA, Typ-I-Kollagen und phosphoryliertem Akt ebenfalls durch NPM-Knockdown herunterreguliert wurde (Abb. 3C). IHC-Färbung und Sirius-Rot-Färbung von Mäuselebergewebe bestätigten ebenfalls die Herunterregulierung von α-SMA und Typ-I-Kollagen (Abb. 3D). Die Expression von NPM korrelierte positiv mit α-SMA und Kollagen (Abb. 3E). Daher hemmte der Abbau von NPM in HSCs die CCl4-induzierte Leberfibrose bei Mäusen signifikant.

Eine NPM-Expression aktivierter HSCs in der Mausleber wurde durch einen Maus-HSC-spezifischen VA-Lippen-siRNA-Komplex mittels Schwanzveneninjektion unterdrückt. Repräsentative Fluoreszenzbilder von α-SMA (rot) und VA-lip-siRNA-FAM (grün) in Leberproben von mit Tetrachlorkohlenstoff behandelten Mäusen mit Leberzirrhose zeigten, dass das VA-lip-siRNA-FAM spezifisch an HSC angereichert war. Den Mäusen (n = 5/Gruppe) wurde alle 3 Tage VA-lip-siNPM oder VA-lip-siNC injiziert (insgesamt 10 Injektionen). Die Leberproben wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion von VA-lip-siRNA-FAM entnommen. B Gelbe Co-Location-Fluoreszenz von NPM und α-SMA zeigte, dass siNPM die NPM-Expression in HSCs signifikant herunterregulierte. C Western-Blot-Analyse von Lebergewebe bestätigte, dass NPM in der Leber signifikant erhöht war. Die Expressionsniveaus von α-SMA, Kollagen I und phosphoryliertem Akt waren signifikant verringert. D IHC-Färbung und Sirius-Rot-Färbung bestätigten, dass der NPM-Spiegel durch VA-lip-siNPM signifikant gesenkt wurde und die Expression von Leberfibrosemarkern wie α-SMA und Kollagen (Sirius-Rot-Färbung) signifikant reduziert wurde. Der E-Pearson-Korrelationstest zeigte, dass NPM positiv mit α-SMA und Kollagen I korreliert. Mittelwert ± SEM; **p < 0,01; T-Test.

NPM ist ein multifunktionales Protein. Kann die Funktion des NPM-Proteins also direkt gehemmt und die Fibrose abgeschwächt werden? Um diese Frage zu beantworten, wurde CIGB300, ein funktioneller Inhibitor des NPM-Proteins mit einer Transmembranpeptidstruktur, in PBS gelöst und über die Schwanzvene den Mäusen mit CCl4-induzierter Leberfibrose verabreicht.

HE- und Siriusrot-Färbung wurden verwendet, um die pathologischen Veränderungen bzw. die Kollagenablagerung im Lebergewebe zu beobachten. CCl4 verursacht Leberschäden durch die Zerstörung oder das Verschwinden normaler Leberläppchen, die durch falsche Läppchen ersetzt werden, Leberzellödeme, Steatose und knotige Regenerationsanordnungen. CIGB300 lindert diese histologischen Veränderungen deutlich (Abb. 4A). Die Sirius-Rot-Färbung zeigte, dass CIGB300 die durch CCl4 verursachte abnormale Kollagenablagerung und Fibrose deutlich reduzierte (Abb. 4B). Die IHC-Analyse zeigte, dass die Phosphorylierung von NPM (Ser125), die in Leberfibrosegeweben deutlich hochreguliert war, durch CIGB300 herunterreguliert wurde (Abb. 4D, E). Immunfluoreszenz (Abb. 4C) und IHC-Analyse (Abb. 4D, E) bestätigten, dass NPM, α-SMA und Kollagen I, die ebenfalls durch CCl4 hochreguliert werden, durch CIGB300 herunterreguliert wurden. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass dies bei NPM der Fall war korrelierte positiv mit α-SMA und Kollagen I, und die Phosphorylierung von NPM (Ser125) korrelierte positiv mit diesen Leberfibrosemarkern (Abb. 4F). Interessanterweise hemmte CIGB300 nicht nur die Phosphorylierung von Ser125, sondern reduzierte auch NPM im Gewebe (Abb. 4D), was darauf hindeutet, dass die Expression und Phosphorylierung von NPM im Lebergewebe auf komplexe Weise reguliert werden könnte. Die durch NPM regulierten nachgeschalteten Moleküle können durch positive Rückkopplung mit verschiedenen Zellen im Lebergewebe interagieren, was zu einer Änderung der NPM-Expression führt. Es ist wichtig zu beachten, dass CIGB300-Ziele nicht zellspezifisch sind, was bedeutet, dass die Funktion von NPM Ser125 in allen Arten von Lebergewebezellen gehemmt sein kann.

Leberfibrose wurde durch intraperitoneale Injektion von CCl4 bei C57BL/6-Mäusen induziert, und CIGB300 wurde in PBS gelöst und über die Schwanzvene verabreicht, um die Funktion des NPM-Proteins zu hemmen. In jede Gruppe wurden fünf Mäuse gegeben. Repräsentative Bilder der HE-Färbung zeigten die Pathologie des Lebergewebes in Mausmodellen der durch CCL4 induzierten Leberfibrose. CIGB300 schützte das Lebergewebe erheblich vor Schäden, die durch CCl4 an Leberzellen und Gewebestrukturen verursacht wurden. Der Maßstabsbalken entspricht 100 μm. B Sirius-Rot-Färbung zeigte eine durch CCl4 induzierte signifikante Ablagerung von Kollagen im Lebergewebe von Mäusen, die nach der Behandlung mit CIGB300 signifikant zurückging (n = 5/Gruppe). Der Maßstabsbalken entspricht 250 μm. C Immunfluoreszenz von Paraffinschnitten zeigte, dass sowohl die NPM- als auch die α-SMA-Expressionsniveaus in den Lebergeweben von CCl4-induzierten Mäusen erhöht waren. Die Behandlung mit CIGB300 reduzierte beides deutlich. Das Expressionsniveau von NPM und α-SMA korrelierte positiv. NPM wurde mit grüner Fluoreszenz markiert und α-SMA wurde mit roter Fluoreszenz markiert. Repräsentative Bilder. Der Maßstabsbalken entspricht 50 μm. D, E IHC-Nachweis zeigte, dass CIGB300 die CCl4-induzierte Hochregulierung von NPM-Protein, NPM S125-Phosphorylierung, α-SMA und Kollagen-I-Protein im Lebergewebe von Mäusen mit Fibrose signifikant hemmte. F Die Analyse quantitativer Daten zeigte eine positive Korrelation zwischen NPM-Protein oder NPM S125-Phosphorylierung und Leberfibrosemarkern im Lebergewebe. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. n ≥ 3; Mittelwert ± SEM; *p < 0,05, ***p < 0,001; T-Test.

Daher korrelierte das NPM im Lebergewebe von Mäusen positiv mit dem α-SMA in HSCs, und die Hemmung der NPM-Proteinfunktion von Lebergewebezellen kann die aktivierten HSCs und die Kollagensekretion reduzieren und dadurch Leberfibrose hemmen.

Die oben erwähnten In-vitro- und In-vivo-Studien bestätigten die Rolle von NPM bei der Förderung der Leberfibrose. Der Mechanismus, durch den NPM die Leberfibrose fördert, wurde an HSCs untersucht. Das aktive nukleare Akt interagiert mit NPM, um die proteolytische Spaltung von NPM zu verhindern [29], aber ob NPM die Akt-Aktivität beeinflusst, bleibt unklar. Der Western-Blot-Assay bestätigte, dass die Akt-Phosphorylierung in HSCs durch den fibrogenen Faktor TGF-β1 hochreguliert wurde (Abb. 5A), jedoch durch NPM-Stummschaltung (Abb. 5B) oder CIGB300-Behandlung (Abb. 5C) signifikant gehemmt wurde. Daher kann NPM die Leberfibrose fördern, indem es den Akt-Signalweg aktiviert. Um diese Hypothese zu testen, wurde MK2206, ein Akt-Inhibitor, zur Behandlung von HSCs eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Leberfibrosemarker α-SMA und Kollagen I herunterreguliert wurden, wenn die Akt-Phosphorylierung unter verschiedenen Konzentrationen von MK2206 gehemmt wurde (Abb. 5D). Während der Akt-Aktivator SC79 α-SMA und Kollagen I in LX-2-Zellen hochregulierte (Abb. 5E). Ähnliche Ergebnisse wurden in den primären hepatischen Sternzellen bestätigt (Abb. 5F). Daher fördert NPM die Leberfibrose, indem es die Akt-Signalübertragung aktiviert.

Ein fibrogener Faktor TGF-β1 regulierte die Akt-Phosphorylierung in LX-2-Zellen hoch. B NPM-Knockout oder -Knockdown hemmte die AKT-Phosphorylierung in hepatischen Sternzellen LX-2. Die Knockout-Effizienz von NPM in LX-2 wurde überprüft und in Abb. 2A dargestellt. C Der NPM-Inhibitor CIGB300 hemmte die AKT-Phosphorylierung in HSCs LX-2. Der D-Akt-Phosphorylierungsinhibitor MK2206 reduzierte die Proteinexpression von Kollagen I, MMP9 und α-SMA in LX-2-Zellen. Der E-Akt-Aktivator SC79 regulierte die Expression von Markern für Leberfibrose hoch. F Kollagen I und α-SMA wurden durch Akt-Inhibitor oder -Aktivator in primären hepatischen Sternzellen entsprechend verringert oder erhöht. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. n ≥ 3; Mittelwert ± SEM; *p < 0,05, ***p < 0,001; T-Test.

Die Aktivierung von HSCs ist das zentrale Ereignis im Prozess der Leberfibrose, und ROS ist ein wichtiges Effektormedium im Anfangsstadium der Leberfibrose, das ruhende HSCs aktivieren kann [30]. Unterschiedliche Mengen an ROS haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen auf Zellen [31]. Moderate ROS inaktivieren PTEN, fördern den PI3K/Akt-Signalweg und führen letztendlich zur Tumorprogression [32]. Übermäßige ROS können die Zellstruktur proliferativer Krebszellen schädigen, insbesondere führt übermäßige ROS zu DNA-Mutationen und beeinträchtigt die genomische Integrität, was zu Zellalterung und Zelltod führt [33]. Unsere früheren Studien bestätigten, dass NPM ROS durch das antioxidative Protein PRDX6 in Tumorzellen herunterreguliert [34, 35]. Daher kann NPM eine schützende Wirkung auf die aktivierten proliferativen HSCs haben, indem es ROS herunterreguliert.

Um die obige Hypothese zu bestätigen, untersuchten wir die Auswirkungen von NPM auf ROS und Apoptose in menschlichen LX-2-Zellen und primären Maus-HSCs. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass nach dem NPM-Knockdown in menschlichen LX-2-Zellen und primären Maus-HSCs intrazelluläres Wasserstoffperoxid und Superoxidanion signifikant hochreguliert waren und Apoptose induziert wurde (Abb. 6A, B, SAbb. 4A). Um in vivo zu verifizieren, dass NPM ROS verringern und die Apoptose von HSCs verringern kann, wiederholten wir das Mausleberfibrose-Modellexperiment in Abb. 3, wobei wir VA-lip-siNPM zur Reduzierung der NPM-Expression von mHSC im Lebergewebe und NAC zur Hemmung von ROS verwendeten. Wir haben eine simultane und schnelle Trenn- und Markierungsmethode (insgesamt etwa 110 Minuten) entwickelt, um den ROS-Status und das Apoptoseniveau primärer HSCs während der Isolierung für die anschließende Durchflusszytometrie-Detektion zu kennzeichnen. WB-Experimente wurden mit den verbleibenden primären hepatischen Sternzellen nach dem Durchflusstest durchgeführt und es wurde bestätigt, dass die Expression von NPM durch VA-lip-siNPM wirksam unterdrückt wurde. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie bestätigten, dass NPM-Knockdown in HSCs die ROS hochregulierte und in Leberfibrosemodellen von Mäusen mehr Apoptose induzierte, während die Hemmung von ROS durch NAC die siNPM-induzierte Apoptose reduzierte (Abb. 4B, Abb. 6C). Der NPM-Inhibitor CIGB300 erhöhte auch die ROS-Werte und steigerte die Apoptose in LX-2-Zellen deutlich (Abb. 6D). Der ROS-Inhibitor N-Acetyl-L-Cystein (NAC) verringerte die CIGB300-induzierte ROS und reduzierte die CIGB300-induzierte Apoptose in LX-2-Zellen und primären mHSCs (Abb. 6D, E, SAbb. 5). Daher hemmt NPM die Apoptose durch Herunterregulieren des ROS-Spiegels, während CIGB300 die Apoptose von HSCs durch Hochregulieren von ROS fördert.

CellROX Orange-Reagenz und Dihydroethidium wurden zur Markierung von intrazellulärem Wasserstoffperoxid und Superoxidanion verwendet. Der ROS-Spiegel und die Apoptose von HSCs wurden mittels Durchflusszytometrie erfasst. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass der NPM-Knockdown die Wasserstoffperoxid- und Superoxidanionen in menschlichen LX-2-Zellen und primären Maus-HSCs deutlich reduzierte. B Die Durchflusszytometrie zeigte, dass der NPM-Knockdown die Apoptose von LX-2 und primären Maus-HSCs signifikant induzierte. C Die Durchflusszytometrieanalyse von primärem HSCS, das aus Lebergewebe fibrotischer Mäuse isoliert wurde, zeigte, dass ROS hochreguliert und die Apoptose erhöht wurde, wenn VA-lip-siNPM die NPM-Expression von HSC im Lebergewebe spezifisch herunterregulierte. Wenn die hochregulierte ROS im Lebergewebe durch NAC herunterreguliert wurde, wurde die Apoptose von HSC verringert (n = 3). D Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass der ROS-Inhibitor NAC dosisabhängig das CIGB-induzierte Wasserstoffperoxid und die Apoptose in LX-2-Zellen hemmte. E NAC hemmte CIGB-induziertes Wasserstoffperoxid und Apoptose in primären Maus-HSCs. Die Ergebnisse der F-Durchflusszytometrie zeigten, dass NAC das MK2206-induzierte Wasserstoffperoxid und die Apoptose in LX-2-Zellen reduzierte. G NAC reduzierte MK2206-induziertes Wasserstoffperoxid und reduzierte die Apoptose in primären Maus-HSCs. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und die Quantifizierungsdaten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt; MFI mittlere Fluoreszenzintensität, WT unbehandelte Zellen, NC-Negativkontrolle, ns nicht signifikanter Unterschied, **p < 0,01, ***p < 0,001; T-Test.

Die Fibroseregression ist mit der Inaktivierung oder Apoptose von HSCs und Myofibroblasten verbunden, was den Tod von HSCs zu einem wichtigen Mechanismus für die Auflösung der Leberfibrose macht [36]. Der Abbau und die Hemmung von NPM inaktivieren sowohl die Akt-Signalübertragung als auch die Erhöhung von ROS und Apoptose. Wir haben die Auswirkungen von Akt auf ROS und Apoptose in HSCs weiter analysiert. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass der Akt-Inhibitor MK2206 den ROS-Spiegel signifikant erhöhte und die Apoptose induzierte, während der ROS-Inhibitor NAC die MK2276-induzierten ROS reduzierte und die Apoptose in LX-2-Zellen (Abb. 6F) und primären mHSCs (Abb. 6G) signifikant reduzierte. Dies bestätigt die Existenz der AKT/ROS-induzierten Apoptoseachse in HSCs.

Zusammenfassend lässt sich aus den obigen Ergebnissen schließen, dass NPM die Leberfibrose fördert, indem es die Apoptose von HSCs über den Akt/ROS/Apoptose-Weg hemmt.

Zusätzlich zum Akt/ROS/Apoptose-Weg haben wir versucht, andere Wege zu finden, die an den fibrotischen Wirkungen von NPM beteiligt sind. In Transkriptomdaten, die mit der DESeq2-Software analysiert wurden, stellten wir fest, dass das lange nichtkodierende RNA-Molekül MIAT das einzige herunterregulierte Gen mit signifikanten Unterschieden nach der Behandlung mit dem Akt-Inhibitor MK2206 war (Abb. 6A), und es wurde gezeigt, dass MIAT daran beteiligt ist Entwicklung einer Nierenfibrose [37]. Wir fragten uns, ob MIAT an der Regulierung der Leberfibrose beteiligt ist. Daher haben wir die MIAT-Expression und ihre fibrosefördernde Wirkung in Leberfibrose-Zellmodellen nachgewiesen.

MIAT stieg in mit TGF-β1 behandelten LX-2-Zellen signifikant an (Abb. 7A). Wir untersuchten weiter die regulatorische Beziehung zwischen NPM, Akt und MIAT und stellten fest, dass der NPM-Knockdown durch siRNA die MIAT-Expression in LX-2-Zellen und primären hepatischen Sternzellen der Maus signifikant verringerte, während der Akt-Inhibitor MK2206 oder der Aktivator SC79 die Expression herunterregulierte oder erhöhte. regulierte MIAT-Expression (Abb. 7B). In Kombination mit der zuvor bestätigten Rolle von NPM bei der Regulierung von Akt bestätigen diese Ergebnisse, dass NPM die Expression von MIAT durch Akt-Signalisierung reguliert.

Eine quantitative PCR zeigte, dass die Expression von MIAT in TGFβ1-behandelten LX-2-Zellen hochreguliert war. B Quantitative PCR zeigte, dass die Expression von NPM durch kleine interferierende RNA beeinträchtigt wurde und der MIAT-Spiegel in LX-2- und LO2-Zellen deutlich herunterreguliert wurde. C Quantitative PCR zeigte, dass die endogene Überexpression von MIAT die Expressionsniveaus von α-SMA, Kollagen und MMP9 hochregulierte. Die endogene Expression von MIAT wurde durch das CRISPR/dCAS9-Genaktivierungssystem hochreguliert. Das sgMIAT ist eine kleine Leit-RNA, die auf die Promotorregion von MIAT abzielt. Inaktiviertes dCas9 bindet an den Promotor, und das fusionierte transkriptionelle aktivierende Element auf dCas9 regulierte die endogene Expression von MIAT deutlich hoch. D-Western-Blot-Ergebnisse bestätigten die hochregulierte Expression von α-SMA, Kollagen I und MMP9 und zeigten, dass MIAT den Cyclin-D1-Spiegel erhöhte. Der CCK8-Proliferationstest zeigte, dass die Proliferationsfähigkeit von LX-2-Zellen nach MIAT-Überexpression oder shRNA/siRNA-Deletion hoch- oder herunterreguliert wurde. F Quantitative PCR zeigte, dass die Expressionsniveaus von Kollagen I und MMP9 nach dem siRNA-Knockdown der MIAT-Expression deutlich abnahmen. G Die quantitative PCR-Analyse zeigte, dass die endogene MIAT-Überexpression die TGF-β2-mRNA hochregulierte und der MIAT-Knockdown die TGF-β2-mRNA verringerte. Die Ergebnisse der H-Western-Blot-Analyse bestätigten, dass die aktivierte MIAT-Expression TGF-β2 und α-SMA in LX-2-Zellen hochregulierte. Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse zeigten, dass die TGF-β2-Behandlung die Expression von Kollagen I und α-SMA in LX-2-Zellen erhöhte. J Die quantitative PCR-Analyse zeigte, dass TGF-β2 MIAT in LX-2-Zellen hochregulierte. K Die Transfektion von LX-2-Zellen mit miR-16-5p-Mimetika reduzierte die Expression von TGF-β2. L Die Aktivierung der endogenen MIAT-Expression in LX-2-Zellen reduzierte die Expression von miR-16-5p, während die Transfektion von miR-16-5p LX-2-Zellen nachahmt und aktiviertes MIAT die endogene MIAT verringerte. M miR-16-5p kann an Sequenzen auf MIAT- und TGF-Β2-RNA-Molekülen binden. Die Sequenzen zwischen den Basen 2601–2909 auf MIAT und 5791–5962 auf TGF-β2-mRNA wurden in die stromabwärts gelegenen Stellen der Luciferase-kodierenden Region des PGL3-Plasmids eingefügt. Der N-Dual-Luciferase-Reporter-Assay zeigte, dass miR-16-5p-Mimetika die Luciferase-Expression reduzierten, Mimetika jedoch keine Bindungswirkung auf die mutierten Bindungsstellen auf MIAT oder TGF-β2 hatten. Eine qPCR-Analyse primärer HSCs, die aus Lebergewebe fibrotischer Mäuse isoliert wurden, zeigte, dass der Akt-Inhibitor MK2206 die Expression von MIAT und TGF-β2 in vivo hemmte, während miR-16-5p-Mimetika auch die Expression von MIAT und TGF-β2 in vivo herunterregulierten mHSC in vivo. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. n ≥ 3; Mittelwert ± SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; T-Test.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von MIAT auf Leberfibrosemarker weiter. Das CRISPR-dCas9-System wurde verwendet, um die Expression von endogenem MIAT zu aktivieren (Abb. 7C), und das hochregulierte MIAT erhöhte die Leberfibrosemarker α-SMA, Kollagen I und MMP9 von LX-2 signifikant (Abb. 7C, D) und förderte die Zellproliferation (Abb. 7E). MIAT-Knockdown verringerte die Proliferation (Abb. 7E) und regulierte Leberfibrosemarker herunter (Abb. 7F). Daher haben wir einen weiteren möglichen Regulierungsweg für NPM zur Förderung der Fibrose durch Akt/MIAT identifiziert.

Um die nachgeschalteten Fibrose-bezogenen Gene zu bestimmen, die durch MIAT reguliert werden, wurde eine RNA-seq-Analyse an den LX-2-Zellen mit herunterreguliertem oder hochreguliertem MIAT durchgeführt. Unter den am unterschiedlichsten exprimierten Genen wurde TGF-β2 durch MIAT hochreguliert (Abb. 6B). Der Hochregulierungseffekt von MIAT auf TGF-β2 wurde durch quantitative PCR und Western Blot in LX-2-Zellen mit aktivierter MIAT-Expression bestätigt (Abb. 7G, H). MIAT-Knockdown reduzierte die TGF-β2-mRNA in HSCs LX-2 (Abb. 7G). Weitere Tests zeigten, dass α-SMA und Kollagen I durch TGF-β2 in LX-2 signifikant hochreguliert wurden (Abb. 7I). Daher kann MIAT die Sekretion von TGF-β2 regulieren und die Expression von Leberfibrosemarkern fördern. Interessanterweise regulierte TGF-β2 auch den MIAT-Spiegel von HSCs hoch, was zu einer positiven Rückkopplung führte (Abb. 7J).

Um den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den MIAT die TGF-β2-Spiegel reguliert, ergab die Sequenzanalyse mit dem DIANA-Tool, dass miR-16-5p mehrere Bindungsstellen auf MIAT-RNA und TGF-β2-mRNA aufwies (SAbb. 7), was darauf hindeutet, dass miR -16-5p könnte als konkurrierende endogene RNA die intrazellulären Spiegel von MIAT und NPM regulieren. Um diese Hypothese zu beweisen, transfizierten wir miR-16-5p-Mimetika in LX-2-Zellen, und die intrazelluläre MIAT und TGF-β2mRNA wurden signifikant herunterreguliert (Abb. 7K, L). Die miR-16-5p-Mimetika regulierten auch das Kollagen Typ I und III sowie die Zellproliferationsfähigkeit von LX-2 herunter (Abb. 8). Vier Nukleotidfragmente um die miR-16-5p-Bindungsstellen auf dem MIAT-Molekül wurden kloniert und in die 3'-UTR der Luciferase des pGL3-Plasmids eingefügt. Das mutierte Fragment wurde als Kontrolle konstruiert (Abb. 7M, SAbb. 9). Ein doppelter Luciferase-Reporter-Assay ergab, dass miR-16-5p-Mimetika an eines der MIAT-Fragmente (2601–2909) binden und die Luciferase-Expression signifikant reduzieren konnten, jedoch nicht an das mutierte Fragment (Abb. 7N). Daher kann miR-16-5p an MIAT binden, um dessen Stabilität zu regulieren. Wir fügten außerdem das miR-16-5p-Bindungsfragment der TGF-β2-mRNA in die 3'-UTR der Luciferase ein, um pGL3-TGF-β2 und ein Kontrollplasmid mit mutierter Stelle zu konstruieren. Der Dual-Luciferase-Reporter-Assay bestätigte, dass miR-16-5p TGF-β2-mRNA binden und deren Spiegel regulieren kann (Abb. 7N).

Um den Akt-MIAT-miR-16-TGF-β2-Signalweg in vivo zu validieren, behandelten wir C57-Mäuse mit Leberfibrose mit einem AKT-Inhibitor, MK2206, um die Wirkung von Akt auf die Downstream-MIAT- und TGF-β2-Genexpression in HSCs zu analysieren. Darüber hinaus verwendeten wir miR-16-5p-Mimetika zur Behandlung von Mäusen mit Leberfibrose und analysierten die Auswirkungen von miR-16-5p auf MIAT und TGF-β2. Nach 36-stündiger Behandlung wurden die Mäuse in der Kontrollgruppe und in jeder Behandlungsgruppe getötet und HSCs aus Lebergewebe isoliert. Die Expressionsänderungen von MIAT und TGF-β2 wurden in den isolierten primären HSCs jeder Gruppe nachgewiesen, um den Einfluss des AKT-Signals auf MIAT und TGF-β2 sowie die fördernde Wirkung von MIAT auf TGF-β2 durch Adsorption zu verifizieren von miR-16-5p. Die qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung des Akt-Signals MIAT-RNA und TGF-β2-mRNA herunterregulierte und die Mimetika von miR-16-5p gleichzeitig MIAT und TGF-β2 in vivo herunterregulieren können (Abb. 7O). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Akt die Expression von MIAT fördert und das hochregulierte MIAT wiederum die TGF-β2-mRNA hochreguliert, indem es miR-16-5p kompetitiv schwächt, wodurch die Expression von Leberfibrosemarkern von HSCs auf autokrine Weise gefördert wird.

Unsere Ergebnisse bestätigten die Existenz eines NPM/MIAT/miR-16-5p/TGF-β2-Regulationswegs in menschlichen HSCs. Die IHC-Färbung menschlicher Gewebearrays mit Lebererkrankungen zeigte, dass TGF-β2 in fibrotischen Geweben hochreguliert war (Abb. 8A). Die IHC-Färbung zeigte, dass das TGF-β2-Protein in fibrotischen Geweben von mit siNPM behandelten Mäusen signifikant herunterreguliert war und die Expression von TGF-β2 stark mit der von NPM korrelierte (P = 0,003, R = 0,8572). TGF-β2 wurde hauptsächlich in den Zellen des Pfortadertrakts und verletzten Hepatozyten exprimiert, und letztere zeigten die charakteristische Kernpyknose nekrotischer Zellen (Abb. 8B, SAbb. 2). Eine weitere Kolokationsanalyse mittels Immunfluoreszenz ergab, dass TGF-β2 hauptsächlich in nekrotischen Hepatozyten und Kupffer-Zellen und nicht in HSCs in fibrotischen Lebergeweben exprimiert wurde (Abb. 8B).

Eine Analyse menschlicher Gewebearrays für Lebererkrankungen (LV20812a, Versuch) zeigte, dass TGF-β2 in fibrotischen Geweben hochreguliert ist. B IHC-Färbung und Immunfluoreszenzanalyse zeigten, dass TGF-β2 hauptsächlich in Leberzellen und Makrophagen verteilt ist. C Western Blot bestätigte, dass die durch CCl4 induzierten nekrotischen Hepatozyten mehr NPM- und TGF-β2-Proteine ​​exprimierten. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit 10 mmol/ml CCl4, gelöst in DMSO, behandelt und nach 24 Stunden wurden die Zellen zur Proteinextraktion gesammelt. Die D-Western-Blot-Analyse bestätigte, dass der NPM-Knockdown in LO2-Zellen die TGF-β2-Expression deutlich herunterregulierte und die Expression von Kollagen I und α-SMA in den mit LO2 kokultivierten LX-2-Zellen abnahm. Die Ergebnisse der E-Western-Blot-Analyse bestätigten, dass die Expression von Markern für Leberfibrose in LX-2-Zellen herunterreguliert wurde, wenn das von LO2-Zellen im Kulturmedium sezernierte TGF-β2 mit Antikörper entfernt wurde. F Im Mäusemodell wurde TGF-β2 während der Genesung Mäusen mit CCl4-induzierter Leberfibrose über die Schwanzvene injiziert. Die Siriusrot-Färbung und die IHC-Analyse zeigten, dass die TGF-β2-Behandlung die Expression von Markern für Leberfibrose und NPM hochregulierte. Die G-Korrelationsanalyse bestätigte, dass TGF-β2 stark mit NPM und Kollagenablagerung korreliert. H Arbeitsmodell von NPM zur Förderung der Leberfibrose. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Mittelwert ± SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; T-Test.

Wenn man bedenkt, dass Hepatozyten den größten Anteil an Zellen im Lebergewebe darstellen, exprimieren nekrotische Hepatozyten möglicherweise viel mehr TGF-β2-Protein als Hepatozyten aus HSCs oder Lebermakrophagen. Um die Hochregulierung des TGF-β2-Proteins in nekrotischen apoptotischen Hepatozyten zu bestätigen, induzierten wir die Nekrose der kultivierten menschlichen Hepatozyten-Zelllinie LO2 unter Verwendung von CCl4. Der Western-Blot-Assay bestätigte, dass sowohl das NPM- als auch das TGF-β2-Protein nach 6 Stunden CCl4-Behandlung zunahmen (Abb. 8C).

Ob NPM in Hepatozyten die Sekretion von TGF-β2 durch Parakrin fördert und somit die Aktivierung von HSCs und die Expression von Fibrosemarkern beeinflusst, muss ermittelt werden. Dementsprechend haben wir NPM in Hepatozyten LO2 ausgeschaltet oder überexprimiert, und die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass sich die TGF-β2-Expression deutlich veränderte. Darüber hinaus wurden die Marker für Leberfibrose in LX-2-Zellen, die zusammen mit LO2-Zellen in Transwell-Kammern kultiviert wurden, herunter- oder hochreguliert (Abb. 8D). Um die Rolle von TGF-β2 im Co-Kultursystem weiter zu bestätigen, entfernten wir das TGF-β2-Protein mittels Immunpräzipitation unter Verwendung des TGF-β2-Antikörpers aus dem Kulturmedium und WB zeigte eine deutlich verringerte α-SMA- und Kollagen-I-Expression in LX -2 Zellen kultiviert in diesem konditionierten Medium (Abb. 8E). Daher kann NPM die Hepatozytensekretion von TGF-β2 aktivieren und so die HSC-Aktivierung und Kollagensynthese fördern.

TGF-β2 wurde in Makrophagen in der Pfortaderregion stark exprimiert und die Expressionsintensität war viel höher als in Hepatozyten oder HSCs (Abb. 8B, SAbb. 3). Um die Wirkung von NPM auf die TGF-β2-Expression in Makrophagen zu bestätigen, haben wir das NPM-Protein in von menschlichen Monozyten THP-1 abgeleiteten Makrophagen und Mausmakrophagen RAW264.7 abgebaut oder überexprimiert. Die WB-Ergebnisse bestätigten, dass das TGF-β2-Protein durch Veränderungen in der NPM-Expression reguliert wurde. Darüber hinaus veränderte sich die Expression von α-SMA und Kollagen I in menschlichen HSCs (LX-2) oder Maus-HSCs (SAbb. 10A, B), die gemeinsam mit Makrophagen kultiviert wurden. Um zu bestätigen, dass die Veränderungen von α-SMA und Kollagen I durch das TGF-β2-Protein verursacht werden, haben wir das TGF-β2-Protein durch Immunpräzipitation weiter aus dem Überstand des Makrophagen-Kulturmediums entfernt. Die Expression von α-SMA und Kollagen I in LX-2 oder Maus-HSCs veränderte sich nach 36 Stunden Kultur in diesem konditionierten Medium signifikant (Abb. 10C), was darauf hindeutet, dass das von Makrophagen sezernierte TGF-β2 die Aktivierung und Kollagenexpression von deutlich beeinflusst HSC im Co-Kultursystem.

TGF-β2 ist an der Fibrose biliärer Lebererkrankungen beteiligt [16]. Die Wirkung von TGF-β2 auf die CCl4-induzierte Leberfibrose bei Balb/c-Mäusen wurde durch Injektion von aktivem TGF-β2 in die Schwanzvene für 4 Wochen nach der CCl4-Induktion bestimmt (Abb. 8F). Die IHC-Färbung (Abb. 8F) und die Western-Blot-Analyse (Abb. 11A) zeigten, dass TGF-β2 die Expression von Kollagen I, NPM und phosphoryliertem AKT erhöhte. CCl4-induzierte Leberfibrose bei C57Bl6J-Mäusen zeigte ähnliche Ergebnisse (Abb. 11B). Die Korrelationsanalyse bestätigte, dass TGF-β2 stark mit NPM und Kollagenablagerung korreliert (Abb. 8G). In Kombination mit früheren Ergebnissen zu Hepatozyten und Makrophagen bestätigten unsere Ergebnisse daher, dass NPM die Sekretion von TGF-β2 in Hepatozyten und Makrophagen förderte, HSCs auf parakrine Weise aktivierte und Leberfibrose förderte.

Zusammenfassend haben wir ein Arbeitsmodell vorgeschlagen, um den Mechanismus zu demonstrieren, durch den NPM die Leberfibrose fördert (Abb. 8H); NPM, das im Lebergewebe weit verbreitet ist, wird während der Leberfibrose durch verschiedene Faktoren hochreguliert. Die Hochregulierung von NPM in HSCs hemmt die ROS-Spiegel und die ROS-induzierte Apoptose weiter, indem sie Akt aktiviert und die PRDX6-Expression reguliert, wodurch die HSC-Aktivierung und die Kollagensekretion gefördert werden. CIGB300, ein Inhibitor der NPM-Phosphorylierung am Ser125, hemmt Akt und reguliert die Apoptose von HSCs hoch, wodurch das Fortschreiten der Leberfibrose gehemmt wird. Darüber hinaus reguliert NPM das nichtkodierende RNA-Molekül MIAT durch Akt hoch und fördert so die Expression und Sekretion von TGF-β2 durch kompetitives Schwämmen von miR-16-5p. TGF-β2, das aus verletzten Hepatozyten, Kupffer-Zellen und HSCs gewonnen wurde, aktiviert die Proliferation und Kollagensekretion von HSCs auf parakrine oder autokrine Weise und fördert den Prozess der Leberfibrose. Angesichts der großen Anzahl von Hepatozyten könnten verletzte Hepatozyten die Hauptquelle für TGF-β2 im Frühstadium der Leberfibrose bei Mäusen sein.

Über die Relevanz zwischen NPM und Leberfibrose wurde nicht berichtet. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die NPM-Stummschaltung oder der NPM-Inhibitor CIGB300 die Leberfibrose sowohl im Tier- als auch im Zellmodell deutlich linderte, was darauf hindeutet, dass NPM die Leberfibrose fördert.

Die Leberfibrose wird durch verschiedene parenchymale und nicht-parenchymale Zellen in der Leber reguliert. Die Immunfärbung zeigte, dass NPM in Hepatozyten, Cholangiozyten sowie in verschiedenen Zellen der Pfortaderregion, einschließlich HSCs und Kupffer-Zellen, exprimiert wurde. Insbesondere in der mit CCl4 behandelten Mausleber wurde NPM stark im Zytoplasma verletzter Hepatozyten exprimiert, die die Pfortaderregion umgeben, was darauf hindeutet, dass NPM nicht auf HSCs beschränkt ist, um eine profibrotische Rolle zu spielen.

Mechanistische Analysen zeigten, dass NPM die Leberfibrose über die Akt/ROS-Achse von HSCs regulieren kann. Die Akt-Signalübertragung reguliert die Zellproliferation und das Überleben und spielt eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung und Rekrutierung von Entzündungszellen, wodurch HSCs aktiviert werden, um Leberfibrose zu fördern [38, 39]. Nuclear Akt interagiert mit NPM und schützt NPM vor proteolytischer Spaltung, wodurch das Zellüberleben verbessert wird [29]. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass NPM wiederum die Akt-Phosphorylierung fördert. Die Wirkung von Akt in HSCs wurde weiter bestimmt und die Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der Akt-Signalübertragung zu einem Anstieg des ROS-Spiegels führt, was die HSC-Apoptose fördert. Darüber hinaus erhöhte der Abbau oder die Hemmung von NPM in HSCs die ROS-Spiegel deutlich, was zu mehr Apoptose führte und die NPM/Akt/ROS-Apoptose-Achse bestätigte. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass NPM die übermäßige ROS durch Hochregulierung des antioxidativen Proteins PRDX6 hemmt und so die Zellen vor Apoptose schützt [34, 35]. Mäßige ROS können HSCs aktivieren, aber übermäßige ROS können die Apoptose fördern [5, 40]. Daher verringerte NPM die ROS in HSCs durch Aktivierung von Akt oder durch Hochregulierung von PRDX6, wodurch die aktivierten HSCs vor Apoptose geschützt und Leberfibrose gefördert wurden.

Es ist zu beachten, dass der genaue Mechanismus, durch den NPM die Akt-Signalübertragung reguliert, noch nicht bekannt ist, frühere Studien jedoch einige Hinweise geliefert haben. Studien haben gezeigt, dass das NPM-Protein direkt an die PH-Domäne des phosphorylierten AKT-Proteins bindet, und diese Wechselwirkung ist entscheidend für die anti-apoptotische Wirkung von NPM [29]. Darüber hinaus ist bekannt, dass PI(3,4,5)P3 auf der Membran an die PH-Domäne von AKT bindet, um die Phosphorylierung von AKT zu fördern und dessen Dephosphorylierung zu verhindern [41]. In Anbetracht dessen, dass NPM sowohl nukleare als auch nukleare Lokalisierungssignale hat und zwischen Zytoplasma und Zellkern wandern kann und hauptsächlich im Nukleolus lokalisiert ist. Darüber hinaus konkurriert nukleares PI(3,4,5)P3 mit Akt um die bevorzugte Bindung von NPM [42]. Daher spekulieren wir, dass NPM die AKT-Signalübertragung fördern könnte, indem es den Keimbildungsprozess, die Stabilität und die Verteilung von phosphoryliertem AKT im Zellkern beeinflusst. Einerseits bindet zytoplasmatisches NPM an die PH-Domäne von AKT, um die Keimbildung von phosphoryliertem AKT zu fördern, und kann auch die Stabilität von phosphoryliertem AKT fördern. Andererseits reichert eingehendes NPM durch seine Lokalisierung im Nukleolus phosphoryliertes AKT an bestimmten Stellen an und fördert so die Wirkung von AKT auf bestimmte Substrate. Die Lokalisierung von Akt im Zellkern trägt dazu bei, seine Substratspezifität zu begrenzen und kontextspezifische zelluläre Reaktionen auszulösen [41]. Die obige Hypothese benötigt noch viele experimentelle Beweise, um ihre Authentizität zu überprüfen.

Die Rolle von NPM bei Leberfibrose ist viel komplexer als die NPM/Akt/ROS/Apoptose-Achse in HSCs. Den Ergebnissen zufolge ist die Phosphorylierung des AKT vollständig blockiert, während die Marker für eine Veränderung der Leberfibrose mild sind, was darauf hindeutet, dass andere Faktoren eine Rolle spielen. Basierend auf der ähnlichen Verteilung von NPM-Protein und TGF-β2-Protein im Leberfibrosegewebe untersuchten wir weiter die regulatorische Beziehung zwischen NPM und TGF-β2, der Quelle des TGF-β2-Proteins im Lebergewebe, und seine Wirkung auf Leberfibrose. Die mechanistische Analyse bestätigte, dass NPM MIAT hochregulierte, was die TGF-β2-Expression durch kompetitives Schwämmen von miR-16-5p förderte. Die Immunfärbungsanalyse zeigte, dass TGF-β2 hauptsächlich in Kupffer-Zellen, Hepatozyten und HSCs exprimiert wurde. Kupffer-Zellen zeigten die höchste Färbeintensität von TGF-β2. Angesichts der zahlenmäßigen Überlegenheit der Hepatozyten ist es jedoch wahrscheinlich, dass TGF-β2 in der Leber hauptsächlich von den verletzten Hepatozyten stammt. Darüber hinaus legen die Ergebnisse unseres Mäusemodells nahe, dass TGF-β2 die CCl4-induzierte Fibrose fördert. Frühere Studien bestätigten auch, dass die TGF-β2-Stummschaltung die biliäre Leberfibrose hemmte [16]. Daher fördert NPM als weiterer profibrotischer Weg von NPM in Kupffer-Zellen, Hepatozyten oder HSCs die Expression und Sekretion von TGF-β2 und aktiviert so HSCs auf parakrine oder autokrine Weise.

Insbesondere fördert NPM die Leberfibrose, aber nicht alle NPM-Inhibitoren können die Leberfibrose reduzieren. CIGB300, das an NPM Ser125 bindet und dessen Phosphorylierung hemmt, hemmte die Leberfibrose, indem es die Akt-Phosphorylierung herunterregulierte. Ein anderer NPM-Oligomerisierungsinhibitor, NSC348884 [28], dessen Mechanismus der NPM-Hemmung immer noch umstritten ist [43, 44], hemmte jedoch die Leberfibrose bei Mäusen aufgrund seiner übermäßigen proapoptotischen Wirkung auf Hepatozyten und HSCs nicht signifikant (Daten nicht gezeigt). Aufgrund der Bedeutung von NPM für die Zellproliferation und Apoptose sollten daher die möglichen Nebenwirkungen der NPM-Hemmung bei der Entwicklung von Medikamenten berücksichtigt werden, die auf NPM abzielen und Leberfibrose hemmen.

Es ist zu beachten, dass die in dieser Studie verwendete Methodik relevante Einschränkungen aufweist. CCl4-induzierte Fibrose ist ein künstliches Modell, das standardisiert und einfach zu verwenden ist und möglicherweise nicht ausreicht, um den Mechanismus, durch den NPM die Fibrose fördert, vollständig aufzuklären. Tatsächlich wurde bei CCl4-induzierter Leberfibrose keine signifikante Gallenreaktion beobachtet, aber eine signifikante Gallenreaktion und eine positive Expression des NPM-Proteins wurden in Gallenepithelzellen auf Mikroarrays für menschliche Lebererkrankungen beobachtet (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass dies auch bei Gallenepithelzellen der Fall sein könnte eine wichtige Quelle für TGF-β2. Darüber hinaus besteht eine weitere methodische Einschränkung darin, dass es keine bedingten Knockout-Mäuse gibt, um die Wirkung auf bestimmte Zelltypen in der Leber zu beschränken, was auf die Tatsache zurückgeführt wird, dass noch keine bedingten Knockout-Mäuse für HSCs etabliert wurden. Daher ist der in der vorliegenden Studie ermittelte Mechanismus auf Toxin-induzierte Leberfibrose beschränkt, und der profibrotische Mechanismus von NPM muss mithilfe eines Gallenfibrosemodells bei Mäusen mit bedingtem Knockout weiter untersucht werden.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass NPM die Leberfibrogenese fördert, indem es die Akt/ROS-induzierte Apoptose in HSCs hemmt und Akt/MIAT-induziertes TGF-β2 in Hepatozyten, Kupffer-Zellen und HSCs hochreguliert. Die Hemmung von NPM oder die Anwendung von NPM-Inhibitoren schwächte die Leberfibrose deutlich ab. NPM dient als potenzieller neuer Angriffspunkt für Medikamente gegen Leberfibrose.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Wang FS, Fan JG, Zhang Z, Gao B, Wang HY. Die globale Belastung durch Lebererkrankungen: die größte Auswirkung Chinas. Hepatologie. 2014;60:2099–108.

Artikel PubMed Google Scholar

Seki E, Schwabe RF. Leberentzündung und Fibrose: funktionelle Zusammenhänge und Schlüsselwege. Hepatologie. 2015;61:1066–79.

Artikel PubMed Google Scholar

[PubMed] Safadi R, Friedman SL. Leberfibrose – Rolle der Aktivierung hepatischer Sternzellen. Medscape Gen Med. 2002;4:27.

Google Scholar

Blaner WS, O'Byrne SM, Wongsiriroj N, Kluwe J, D'Ambrosio DM, Jiang H, et al. Lipidtröpfchen aus hepatischen Sternzellen: ein spezielles Lipidtröpfchen für die Retinoidspeicherung. Biochim Biophys Acta. 2009;1791:467–73.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cichoz-Lach H, Michalak A. Oxidativer Stress als entscheidender Faktor bei Lebererkrankungen. Welt J Gastroenterol. 2014;20:8082–91.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Henderson NC, Iredale JP. Leberfibrose: zelluläre Mechanismen des Fortschreitens und der Auflösung. Klinische Wissenschaft. 2007;112:265–80.

Artikel CAS Google Scholar

Friedman SL. Hepatische Sternzellen: vielschichtige, multifunktionale und rätselhafte Zellen der Leber. Physiol Rev. 2008;88:125–72.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gressner AM, Weiskirchen R. Moderne pathogenetische Konzepte der Leberfibrose legen Sternzellen und TGF-beta als Hauptakteure und therapeutische Ziele nahe. J Cell Mol Med. 2006;10:76–99.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lam S, Man K, Ng KTP, Fan ST, Lo CM. Die Bedeutung der Aktivierung hepatischer Sternzellen bei Verletzungen kleiner Fettlebertransplantate. Lebertranspl. 2005;11:C6–C.

Google Scholar

Hernandez-Gea V, Friedman SL. Pathogenese der Leberfibrose. Annu Rev Pathol-Mech. 2011;6:425–56.

Artikel CAS Google Scholar

Herbertz S., Sawyer JS, Stauber AJ, Gueorguieva I, Driscoll KE, Estrem ST, et al. Klinische Entwicklung von Galunisertib (LY2157299-Monohydrat), einem niedermolekularen Inhibitor des Signalwegs des transformierenden Wachstumsfaktors Beta. Drug Des Dev Ther. 2015;9:4479–99.

CAS Google Scholar

Kirmaz C, Terzioglu E, Topalak O, Bayrak P, Yilmaz O, Ersoz G, et al. Serumtransformierender Wachstumsfaktor Beta1 (TGF-Beta1) bei Patienten mit Zirrhose, chronischer Hepatitis B und chronischer Hepatitis C [korrigiert]. Eur Cytokine Netw. 2004;15:112–6.

CAS PubMed Google Scholar

Bissell DM, Wang SS, Jarnagin WR, Roll FJ. Zellspezifische Expression des transformierenden Wachstumsfaktors Beta in Rattenleber – Beweis für eine autokrine Regulation der Hepatozytenproliferation. J Clin Invest. 1995;96:447–55.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dropmann A, Dediulia T, Breitkopf-Heinlein K, Korhonen H, Janicot M, Weber SN, et al. TGF-beta1- und TGF-beta2-Häufigkeit bei Lebererkrankungen von Mäusen und Männern. Oncotarget. 2016;7:19499–518.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun TH, Huang ZY, Liang WC, Yin JP, Lin WY, Wu J, et al. TGF-Beta-2- und TGF-Beta-3-Isoformen steuern die Pathogenese fibrotischer Erkrankungen. Sci Transl Med. 2021;13:eabe0407.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dropmann A, Dooley S, Dewidar B, Hammad S, Dediulia T, Werle J, et al. TGF-beta2-Stummschaltung zur Bekämpfung biliärer Lebererkrankungen. Darm. 2020;69:1677–90.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang N, Negi S, Szebeni A, Olson MO. Protein NPM3 interagiert mit dem multifunktionalen Nukleolarprotein B23/Nukleophosmin und hemmt die Ribosomenbiogenese. J Biol. Chem. 2005;280:5496–502.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta S, Akey IV, Dingwall C, Hartman KL, Laue T, Nolte RT, et al. Die Kristallstruktur des Nukleoplasminkerns: Auswirkungen auf die Histonbindung und den Nukleosomenaufbau. Mol Zelle. 2001;8:841–53.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Okuda M. Die Rolle von Nukleophosmin bei der Zentrosomenduplikation. Onkogen. 2002;21:6170–4.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kondo T, Minamino N, NagamuraInoue T, Matsumoto M, Taniguchi T, Tanaka N. Identifizierung und Charakterisierung von Nukleophosmin/B23/Numatrin, das den antionkogenen Transkriptionsfaktor IRF-1 bindet und onkogene Aktivität zeigt. Onkogen. 1997;15:1275–81.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hsu CY, Yung BYM. Eine Überexpression von Nukleophosmin/B23 verringert die Anfälligkeit menschlicher Leukämie-HL-60-Zellen für Retinsäure-induzierte Differenzierung und Apoptose. Int J Krebs. 2000;88:392–400.

3.0.CO;2-7" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0215%2820001101%2988%3A3%3C392%3A%3AAID-IJC11%3E3.0.CO%3B2-7" aria-label="Article reference 21" data-doi="10.1002/1097-0215(20001101)88:33.0.CO;2-7">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ihr KQ. Nucleophosmin/B23, ein multifunktionales Protein, das die Apoptose regulieren kann. Krebs Biol. Ther. 2005;4:918–23.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grisendi S, Mecucci C, Falini B, Pandolfi PP. Nucleophosmin und Krebs. Nat Rev. Krebs. 2006;6:493.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tsui KH, Cheng AJ, Chang P, Pan TL, Yung BY. Zusammenhang zwischen Nukleophosmin/B23-mRNA-Expression und klinischem Ergebnis bei Patienten mit Blasenkarzinom. Urologie. 2004;64:839–44.

Artikel PubMed Google Scholar

Perera Y, Farina HG, Gil J, Rodriguez A, Benavent F, Castellanos L, et al. Das Antikrebspeptid CIGB-300 bindet an Nukleophosmin/B23, beeinträchtigt dessen CK2-vermittelte Phosphorylierung und führt durch seine nukleoläre Zerlegungsaktivität zur Apoptose. Mol Krebs Ther. 2009;8:1189–96.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

[ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] Sato Y, Murase K, Kato J, Kobune M, Sato T, Kawano Y, et al. Auflösung einer Leberzirrhose mithilfe von Vitamin A-gekoppelten Liposomen zur Abgabe von siRNA gegen ein kollagenspezifisches Chaperon. Nat Biotechnol. 2008;26:431–42.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Peng B, Liu F, Han R, Luo G, Cathopoulis T, Lu K, et al. Dynamische Stoffwechselveränderungen weisen auf eine entzündungsbedingte Transformation von Leberzellen hin. Int J Biochem Cell B. 2015;66:45–58.

Artikel CAS Google Scholar

Di Matteo A, Franceschini M, Chiarella S, Rocchio S, Travaglini-Allocatelli C, Federici L. Moleküle, die auf Nukleophosmin zur Krebsbehandlung abzielen: ein Update. Oncotarget. 2016;7:44821–40.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee SB, Xuan Nguyen TL, Choi JW, Lee KH, Cho SW, Liu Z, et al. Nuclear Akt interagiert mit B23/NPM und schützt es vor proteolytischer Spaltung, wodurch das Zellüberleben verbessert wird. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:16584–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramos-Tovar E, Muriel P. Molekulare Mechanismen, die oxidativen Stress, Entzündung und Fibrose in der Leber verbinden. Antioxidantien. 2020;9:1279.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao Y, Hu XB, Liu YJ, Dong SM, Wen ZW, He WM, et al. ROS-Signalisierung unter metabolischem Stress: Wechselwirkung zwischen AMPK- und AKT-Signalweg. Mol-Krebs. 2017;16:79.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Standort JW, Cantley LC. Stoffwechselfluss und Regulierung des Zellwachstums von Säugetieren. Zellmetabolismus 2011;14:443–51.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gorrini C, Harris IS, Mak TW. Modulation von oxidativem Stress als Antikrebsstrategie. Nat Rev Drug Discov. 2013;12:931–47.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu GY, Shi JX, Shi SL, Liu F, Rui G, Li X, et al. Nucleophosmin reguliert die intrazelluläre Homöostase von oxidativem Stress über das Antioxidans PRDX6. J Cell Biochem. 2017;118:4697–707.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang D, Li Y, Liu Y, Cheng S, Liu F, Zuo R, et al. NPM1 fördert die Zellproliferation, indem es PRDX6 bei Darmkrebs angreift. Int J Biochem Cell Biol. 2022;147:106233.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roehlen N, Crouchet E, Baumert TF. Leberfibrose: mechanistische Konzepte und therapeutische Perspektiven. Zellen. 2020;9:875.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bijkerk R, Au YW, Stam W, Duijs JMGJ, Koudijs A, Lievers E, et al. Lange nichtkodierende RNAs Rian und Miat vermitteln die Myofibroblastenbildung bei Nierenfibrose. Front Pharmacol. 2019;10:215.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aleffi S, Petrai I, Bertolani C, Parola M, Colombatto S, Novo E, et al. Hochregulierung proinflammatorischer und proangiogener Zytokine durch Leptin in menschlichen hepatischen Sternzellen. Hepatologie. 2005;42:1339–48.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bataller R, Paik YH, Lindquist JN, Lemasters JJ, Brenner DA. Kern- und Nichtstrukturproteine ​​des Hepatitis-C-Virus induzieren fibrogene Wirkungen in hepatischen Sternzellen. Gastroenterologie. 2004;126:529–40.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kaminskyy VO, Zhivotovsky B. Freie Radikale im Kreuzgespräch zwischen Autophagie und Apoptose. Antioxid-Redox-Signal. 2014;21:86–102.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yudushkin I. Kontrolle der Akt-Aktivität und Substratphosphorylierung in Zellen. IUBMB Leben. 2020;72:1115–25.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kwon IS, Lee KH, Choi JW, Ahn JY. PI(3,4,5)P3 reguliert die Interaktion zwischen Akt und B23 im Zellkern. BMB Rep. 2010;43:127–32.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Qi W, Shakalya K, Stejskal A, Goldman A, Beeck S, Cooke L, et al. NSC348884, ein Nukleophosmin-Inhibitor, stört die Oligomerbildung und induziert Apoptose in menschlichen Krebszellen. Onkogen. 2008;27:4210–20.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sasinkova M, Herman P, Holoubek A, Strachotova D, Otevrelova P, Grebenova D, et al. Die Zytotoxizität von NSC348884 wird nicht durch die Hemmung der Nucleophosmin-Oligomerisierung vermittelt. Sci Rep. 2021;11:1084.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81670542, 82273044), des Fujian Provincial Social Development Guiding (key) Project (2021Y0001) und des Fujian Provincial Natural Science Foundation Project (2021J011351) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xue Ding, Xin-Le Zhu, Dong-Hui Xu, Shuang Li, Qiong Yang.

Krebsforschungszentrum, Medizinische Fakultät, Universität Xiamen, Xiamen, China

Xue Ding, Xin-Le Zhu, Dong-Hui Xu, Shuang Li, Qiong Yang, Xian Feng, Yong-Gui Wei, Huan Li, Ling Yang, Xiao-Ling Deng und Song-Lin Shi

Abteilung für medizinische Grundlagenwissenschaften, Medizinische Fakultät, Universität Xiamen, Xiamen, China

Xue Ding, Xin-Le Zhu, Yu-Jun Zhang und Song-Lin Shi

Abteilung für hepatische biliäre Pankreas-Gefäßchirurgie, das erste angegliederte Krankenhaus der Universität Xiamen, Medizinische Fakultät der Universität Xiamen, Xiamen, China

Dong-Hui Xu

Xiang'an-Krankenhaus der Universität Xiamen, Medizinische Fakultät, Universität Xiamen, Xiamen, China

Kuan-Can Liu

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Die Arbeit der Autoren in dieser Studie ist wie folgt aufgeführt: Tiermodell und histopathologische Analyse XD und XLZ. MIAT-Analyse und Dual-Luciferase-Reporter-Assay SL, RNA-seq-Analyse SL, WB-Test QY, XLZ, XF, YGW, HL und YL; Echtzeit-PCR SL, QY und XLZ; und Gewebe-Microarray-Analyse DHX, YJZ, XD und XLZ. Primäre Zellisolierung XLZ und SLS. ROS- und Apoptose-Nachweis XD und XF. KCL und XLD analysierten Daten. SLS konzipierte und überwachte die Studie und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Kuan-Can Liu oder Song-Lin Shi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Herausgegeben von Boris Schiwotowski

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ding, X., Zhu, XL., Xu, DH. et al. NPM fördert die Hepatotoxin-induzierte Fibrose, indem es die ROS-induzierte Apoptose hepatischer Sternzellen hemmt und den lncMIAT-induzierten TGF-β2 hochreguliert. Cell Death Dis 14, 575 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06043-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 20. Februar 2023

Überarbeitet: 25. Juli 2023

Angenommen: 04. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-06043-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt