Diffusionsfähige Signalfaktoren (DSFs) binden und unterdrücken VirF, den führenden Virulenzaktivator von Shigella flexneri

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13170 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Shigella, der ätiologische Erreger der menschlichen Bakterienruhr, kontrolliert die Expression seiner Virulenzdeterminanten durch eine umweltstimulierte Kaskade von Transkriptionsaktivatoren. VirF ist der führende Aktivator und für die ordnungsgemäße Expression der Virulenz unerlässlich. In dieser Arbeit berichten wir über In-vitro- und In-vivo-Experimente, die zeigen, dass zwei Autoinduktoren der DSF-Familie, XcDSF und BDSF, mit dem Jelly-Roll-Modul von VirF interagieren, wodurch dessen Hemmung verursacht und die Expression des gesamten Virulenzsystems von Shigella, einschließlich Shigella, beeinflusst wird Fähigkeit, in Epithelzellen einzudringen. Wir schlagen ein molekulares Modell vor, das erklärt, wie die Bindung von XcDSF und BDSF eine Hemmung von VirF bewirkt, indem es dessen Dimerisierung verhindert. Insgesamt deuten unsere experimentellen Ergebnisse darauf hin, dass XcDSF und BDSF zur „Kolonisierungsresistenz“ im menschlichen Darm beitragen oder alternativ zur Feinabstimmung der Shigella-Virulenzexpression genutzt werden können, wenn das Bakterium aus dem Lumen in die Darmschleimhaut wandert. Unsere Ergebnisse unterstreichen auch, wie ein detailliertes Verständnis der Wechselwirkung von DSF-Liganden mit VirF zur rationalen Entwicklung innovativer Antivirulenzmedikamente zur Behandlung von Shigellose beitragen kann.

Shigella ist ein enteropathogenes gramnegatives Bakterium, das für Shigellose verantwortlich ist, eine Krankheit, von der weltweit jährlich etwa 125 Millionen Menschen betroffen sind und die in etwa 164.000 Fällen tödlich endet1,2. Um die menschliche Darmschleimhaut zu infizieren, nutzt Shigella ein spezifisches Typ-III-Sekretionssystem (T3SS), um die bakterielle Invasion zu fördern, indem es eine Reihe von Faktoren in das Zytoplasma der Wirtszelle injiziert3. Die Gene, die für die Proteinkomponente dieses T3SS kodieren, die an seinem Aufbau beteiligten Faktoren und die injizierbaren Effektoren sind in einer großen Pathogenitätsinsel (PAI)-ähnlichen Region innerhalb des Shigella-Virulenzplasmids (pINV) geclustert4. Die Expression der T3SS-Gene wird durch eine Regulierungskaskade gesteuert, die durch den AraC-XylS-Transkriptionsregulator VirF ausgelöst wird, der sich an der Spitze der Kaskade befindet5,6. Das VirF-Protein fördert die Transkription von zwei Genen, die für die Virulenz von Shigella entscheidend sind: icsA und virB. Das IcsA-Protein ist an der intrazellulären bakteriellen Motilität beteiligt7,8 und das VirB-Protein, das als zweiter positiver Regulator des Virulenzsystems fungiert, ist für die Expression der zugrunde liegenden Ebenen der Shigella-Regulationskaskade verantwortlich9,10. Bemerkenswert ist, dass es sich bei den Genen virF, virB und icsA um pINV-Plasmidgene handelt, die außerhalb der PAI-ähnlichen Region liegen. VirF wird auf Transkriptionsebene durch verschiedene Umweltreize wie Temperatur, pH-Wert und Osmolarität und auf posttranskriptioneller Ebene durch MiaA10 reguliert. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die Aktivität von VirF auch direkt durch Fettsäuren (FAs) gesteuert wird11. Insbesondere FAs wie Laurinsäure, Caprinsäure, Myristoleinsäure, Palmitoleinsäure und Sapiensäure binden VirF und inaktivieren seine transkriptionsfördernde Aktivität, wahrscheinlich indem sie bewirken, dass sich die Proteinstruktur von einem freien, funktionellen („offenen“) Zustand in einen FA-gebundenen Zustand ändert , nichtfunktionale („geschlossene“) Form. Ein ähnlicher Mechanismus, an dem FAs beteiligt sind, wurde zuvor für andere Virulenzregulatoren vorgeschlagen, wie ToxT von V. cholerae, Rns von enterotoxigenen E. coli (ETEC) und HilD von Salmonella enterica12,13,14. Kürzlich wurde cis-2-Hexadecensäure zu den Liganden gezählt, die HilD binden und hemmen und so die Virulenzgenexpression von S. enterica beeinflussen14,15. Diese Verbindung gehört zu einer seltenen Klasse von FAs, die von gramnegativen Bakterien synthetisiert werden und als „Diffusible Signalfaktoren“ (DSFs) bezeichnet werden. DSFs umfassen FAs mit unterschiedlichen Kettenlängen und Verzweigungsmustern mit einer ungesättigten cis-Bindung an Position 2, mit Ausnahme von 13-Methyltetradecansäure (LeDSF). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DSFs als Signalmoleküle in bakteriellen Quorum-Sensing-Systemen (QS) dienen16,17 und verschiedene Funktionen in einer Vielzahl von Bakterien, einschließlich pflanzlicher und tierischer Krankheitserreger, regulieren17,18. Ein Prototyp eines DSF-Moleküls ist cis-11-Methyl-2-dodecensäure (XcDSF), das vom phytopathogenen Bakterium Xanthomonas campestris17,19 produziert wird. Zu den anderen wichtigen, zuvor charakterisierten Mitgliedern der DSF-Familie gehören cis-2-Decensäure (PDSF); cis-2-Dodecensäure (BDSF); cis, cis-11-Methyldodeca-2, 5-diensäure (CDSF); cis-10-Methyl-2-dodecensäure (IDSF); cis-2-Tetradecensäure (XfDSF1); und cis-2-Hexadecensäure (XfDSF2). Bakterien, die DSFs synthetisieren, sind Teil einer ständig aktualisierten Liste und zeichnen sich durch das Vorhandensein des rpfF-Gens (oder eines Homologen davon) aus, das für die DSF-Synthese entscheidend ist17,20. Bisher umfasst die Liste der DFS-Produzenten Xanthomonas spp., Bakterien der Gattungen Frateria, Luteobacter, Pseudoxhantomonas und Rhodanobacter können basierend auf der In-silico-Vorhersage ebenfalls einbezogen werden17. Der Genort, der sowohl für die Produktion von DSFs als auch für deren Erkennung als Quorum-Sensing-Signal verantwortlich ist, wurde zum ersten Mal in X. campestris charakterisiert und umfasst vier Gene: rpfC, rpfG, rpfB und rpfF18,21,22. RpfC und RpfG bilden ein Zweikomponentensystem, während RpfB eine Ligase für langkettige Acyl-CoA-Moleküle ist. RpfF ist ein Enzym der Crotonase-Superfamilie (Enoyl-CoA-Dehydratase- und Thioesterase-Aktivitäten) und wirkt auf ein Acyl-Transporterprotein (Acyl-ACP), ein Zwischenprodukt der Fettsäuresynthese, um XcDSF zu synthetisieren. Wenn die Bakterienpopulation eine kritische Dichte erreicht, interagiert XcDSF mit dem RpfC-Sensor und induziert die Phosphorylierung des RpfG-Antwortregulatorproteins. Aufgrund seiner hydrolytischen Aktivität wandelt das phosphorylierte RpfG den Second Messenger Bis-(3'-5')-zyklisches GMP (c-di-GMP) in GMP um. Eine Abnahme des intrazellulären c-di-GMP führt zur Deregulierung von Zielgenen18. In Burkholderia cenocepacia hängt die Biosynthese von DSF-Molekülen (BDSF) vollständig von RpfFBc ab, einem bifunktionellen Enzym mit Enoyl-CoA-Hydratase- und Thioesterase-Aktivität. Dieses Enzym weist eine signifikante Sequenzidentität mit dem RpfF-Protein von X. campestris auf. Trotz der großen Ähnlichkeit von XcDSF und BDSF im Biosyntheseweg und der chemischen Struktur unterscheidet sich der Mechanismus, durch den B. cenocepacia BDSF wahrnimmt, von dem in X. campestris charakterisierten, da er einen zytoplasmatischen Rezeptor, das RpfR-Protein, einbezieht. Dieses Enzym zeigt zyklische Di-GMP-Phosphodiesterase-Aktivität, sobald es an BDSF gebunden ist, was zu einer Abnahme des zytoplasmatischen c-di-AMP führt23. Interessanterweise ähnelt dieser Erkennungs- und Regulierungsmechanismus stark der Wechselwirkung zwischen HilD und cis-2-Hexadecensäure, die eine Unterdrückung der Virulenz von S. enterica bewirkt. In Anbetracht der hohen strukturellen Ähnlichkeit zwischen In der vorliegenden Studie zeigen wir durch In-silico-, In-vitro- und In-vivo-Experimente, dass XcDSF und BDSF direkt mit VirF interagieren, was zu einer signifikanten Abnahme der virB-Transkription führt, wodurch die Expression des gesamten Virulenzsystems von Shigella behindert und a verursacht wird defekter Phänotyp, der durch eine unzureichende Invasion der Wirtszellen und eine verzögerte Proliferation in ihnen gekennzeichnet ist.

Um die mögliche hemmende Wirkung von DSFs-Molekülen auf das Shigella-Virulenzsystem zu untersuchen, haben wir zunächst die subhemmenden Konzentrationen von XcDSF oder BDSF auf das Wachstum des Shigella-Stamms M90T in LB-Medium bestimmt. Die Kettenlänge beider DSFs entspricht der von Laurinsäure, von der wir zuvor gezeigt haben, dass sie ein wirksamer VirF-Inhibitor ist11. Zu diesem Zweck wurden den M90T-Kulturen steigende Konzentrationen von XcDSF oder BDSF bis zu einer Endkonzentration von 0,2 %, 0,02 % oder 0,002 % zugesetzt und das Wachstum anschließend überwacht. Die Wachstumskurven (Abb. S2A und B) zeigen deutlich, dass für beide DSFs 0,02 % die höchste Konzentration ist, bei der das Wachstum nicht wesentlich beeinflusst wird. Daher untersuchten wir durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) nach Exposition von Kulturen gegenüber 0,02 % XcDSF oder BDSF die Transkription des virF- und VirF-abhängigen virB-Gens. Darüber hinaus haben wir die Analyse auf das icsA-Gen ausgeweitet, um die mögliche hemmende Wirkung von XcDSF und BDSF auf die VirF-Aktivität zur Förderung der Transkription weiter zu bestätigen. Im Vergleich zum unbehandelten Stamm (NT) ist die relative Menge des virF-Transkripts leicht erhöht, wohingegen die Menge der virB- und icsA-Transkripte um etwa 70 % bzw. 60–65 % verringert ist (Abb. 1). Um zu testen, ob die verminderte Transkription des virB-Gens, das für die korrekte Expression des gesamten Virulenzsystems von Shigella entscheidend ist, von einer negativen Modulation der VirF-Translation abhängt, führten wir einen Western-Blot-Assay mit Gesamtproteinextrakten aus Shigella-M90T-Kulturen durch, die VirF-Flag exprimieren -markierte (M90T VirF-FT) oder VirB-Flag-markierte Proteine (M90T VirB-FT), gezüchtet in Gegenwart von XcDSF und BDSF. Eine vergleichende densitometrische Analyse der Proteinbanden zeigt, dass die Proteingehalte von VirF (Abb. 2A) und VirB (Abb. 2B) mit den Transkriptionsprofilen übereinstimmen, was bestätigt, dass die Menge an VirF-Protein durch das Vorhandensein getesteter DSFs nicht beeinflusst wird. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass XcDSF und BDSF die virB-Transkription durch die Hemmung der die Transkription von VirF fördernden Aktivität beeinflussen.

Vergleichende Analyse der Transkriptionsprofile der virF-, virB- und icsA-Gene in S. flexneri nach XcDSF- oder BDSF-Behandlung. Vergleichende Analyse der Transkriptionsprofile der virF-, virB- und icsA-Gene im Stamm M90T S. flexneri, der in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,02 % XcDSF und BDSF gezüchtet wurde. Die Daten werden durch qRT-PCR erhalten und die Werte werden mit der entsprechenden unbehandelten Probe verglichen, die auf 1 gesetzt ist. Die Ergebnisse sind ein Durchschnitt von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen SD dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem gepaarten zweiseitigen Student-t-Test bestimmt, wobei die Messungen der unbehandelten und behandelten Proben als Datensatz verwendet wurden. *p ≤ 0,01.

Vergleichende Translationsprofile des VirF- und VirB-Proteins in S. flexneri nach XcDSF- oder BDSF-Behandlung. Western-Blot-Analyse der Proteine VirF (A) und VirB (B) im Stamm M90T S. flexneri, der in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,02 % XcDSF und BDSF gezüchtet wurde. Western-Blot-Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die densitometrischen Analysewerte aller Experimente wurden verwendet, um die Balkendiagramme unter dem entsprechenden WB zu erstellen. Die Werte wurden durch Normalisierung der VirF- und VirB-Proteinspiegel auf die des OmpA-Proteins erhalten und mit den Werten der unbehandelten Proben (NT) verglichen, die auf 1 gesetzt waren. Fehlerbalken stellen SD dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem gepaarten zweiseitigen Student-t-Test bestimmt. *p ≤ 0,01.

Basierend auf den im vorherigen Abschnitt präsentierten Daten nehmen wir an, dass XcDSF und BDSF möglicherweise ähnlich wie andere Fettsäuren (FAs) wirken, die wir kürzlich untersucht haben11, d. h. sie könnten direkt mit dem VirF-Jelly-Roll-Modul, einer aus acht Proteinen bestehenden Unterstruktur, interagieren Beta-Stränge sind in zwei viersträngigen Schichten angeordnet, was zu einer strukturellen Veränderung und folglich zur Hemmung der die Transkription fördernden VirF-Aktivität führt. Wir haben diese Hypothese mithilfe eines DNA-Protein-Interaktionsplattentests (DPIPA)11 getestet, der darauf abzielte, die Wechselwirkung des gereinigten VirF-Proteins (MalE-VirF) mit PvirB zu untersuchen, einem 194-bp-FITC-markierten Amplifikat, das die proximale Bindungsstelle von VirF umfasst der virB-Promotor24. Die Ergebnisse (Abb. 3) zeigen, dass das relative Bindungsverhältnis des MalE-VirF-Proteins an PvirB-DNA in Gegenwart von Zwei DSFs beeinflussen eindeutig die Interaktion von VirF mit dem virB-Promotor. Es wurde gezeigt, dass die Dimerisierung eine wesentliche Voraussetzung für VirF (sowie für ToxT- und Rns-Proteine) ist, um DNA zu binden und die Expression von Zielgenen zu aktivieren25,26,27,28. Es ist plausibel, dass die Bindung von XcDSF oder BDSF die VirF-Dimerisierung beeinflusst. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde eine molekulare Docking-Analyse unter Verwendung der zuvor vorhergesagten Struktur des VirF-Modells durchgeführt11. Die strukturelle Übereinstimmung der vorhergesagten XcDSF-gebundenen VirF-Struktur und der dimeren Struktur der Master-Regulator-Rns aus E. coli in Apo-Form (PDB: 6XIU, 37 % Sequenzidentität)13 unterstützt einen Mechanismus der Hemmung der VirF-Dimerisierung durch die beiden DSFs getestet (Abb. 4). Insbesondere wird die Anordnung der hochkonservierten α3-Helix von VirF, die homolog zur Helix von Rns ist, die die Homodimer-Schnittstelle bildet, in einem Winkel vorhergesagt, der eine Dimerisierung verhindert, wenn eine Bindung an die beiden DSFs erfolgt. Da die α3-Helix von VirF für die Dimerisierung entscheidend ist25, legt diese Beobachtung nahe, dass die XcDSF- oder BDSF-Bindung die Dimerisierung und die anschließende DNA-Bindung von VirF durch Beeinflussung der Position der α3-Helix hemmen könnte.

In-vitro-Bewertung der Bindung von VirF an den virB-Promotor in Gegenwart oder Abwesenheit von XcDSF oder BDSF. Das Balkendiagramm zeigt die Menge an Fluoreszenz, die von der PvirB-FITC-DNA emittiert wird, die vom VirF-Protein in den Vertiefungen zurückgehalten wird, in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,02 % XcDSF oder BDSF. Das Experiment wurde mit sättigenden Konzentrationen des PvirB-FITC-DNA-Fragments (75 ng) durchgeführt und die Ergebnisse stellen den Durchschnitt von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen SD dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem gepaarten zweiseitigen Student-t-Test bestimmt. *p ≤ 0,01.

Vorgeschlagenes Wirkungsmodell von XcDSF oder BDSF. Das in der Abbildung hypothetische Modell basiert auf der strukturellen Ähnlichkeit zwischen VirF und den anderen Mitgliedern der AraC-Familie. Dieser Hypothese zufolge ist die Bindung von XcDSF oder BDSF an die Jelly-Roll-Domäne für eine allosterische Neuorientierung der Helix α3 verantwortlich, die wiederum Teil der Dimerschnittstelle von VirF ist. Ein solcher allosterischer Übergang verhindert die Dimerbildung und die anschließende DNA-Bindung.

Um zu untersuchen, ob die Wechselwirkung von Diese Stämme exprimieren mutierte VirF-Proteine, die nicht mehr empfindlich auf die Hemmung von Fettsäuren, einschließlich Laurinsäure, reagieren11. Die molekulare Docking-Analyse sagt eindeutig voraus, dass die VirF-Reste H17 und H212, ähnlich wie im Fall von Laurinsäure, für die XcDSF- oder BDSF-VirF-Wechselwirkung von hoher Relevanz sein sollten (Abb. 5A). Das Ergebnis der qRT-PCR-Assays zeigt, dass die relative Menge an virB-Transkript in den Stämmen, die die mutierte Form von VirF tragen und mit XcDSF oder BDSF behandelt wurden, dem in unbehandelten Proben nachgewiesenen entspricht, während die Menge an virB-Transkript in dem Stamm, der die mutierte Form von VirF exprimiert, gleichwertig ist Das Wildtyp-VirF-Protein ist stark vermindert (auf etwa 30 %) (Abb. 5B). Diese Beobachtungen bestätigen, dass beide Mutationen die virB-Regulation beeinflussen und die XcDSF-/BDSF-abhängige Repression aufheben. Zusammen mit den In-vitro-Ergebnissen deuten sie stark darauf hin, dass die Wechselwirkung von XcDSF und BDSF mit VirF auch in vivo auftritt, was zu einer Verringerung der VirB-Expression führt und damit des gesamten Virulenzsystems.

Rolle der H17- und H212-Reste bei der XcDSF- und BDSF-Wechselwirkung mit dem VirF-Protein. (A) Das dimere Modell von VirF wird gezeigt, wobei ein Monomer als graue Oberfläche und das andere als weißer Cartoon dargestellt wird. XcDSF wird als grüne Stäbchen dargestellt, während die beiden Histidinreste, die mit dem Liganden interagieren, cyan/blaue Stäbchen sind. Die Tafel stellt den Hohlraum dar, der den Liganden beherbergt, und die Histidinreste, von denen vorhergesagt wird, dass sie mit dem Liganden interagieren, werden angezeigt. (B) Die Grafik zeigt die relative Transkription des virB-Gens in Gegenwart des VirF-Wildtyp-Proteins, der H17A-, H212A- und H17A/H212A-Derivate, behandelt mit 0,02 % XcDSF (dunkelgraue Balken) oder BDSF (hellgraue Balken). ). Die relativen Werte wurden anhand der Werte der entsprechenden unbehandelten Probe berechnet und auf 1 gesetzt. Die Ergebnisse sind ein Durchschnitt von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen SD dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen Student-t-Test anhand der Messwerte der unbehandelten und behandelten Proben bestimmt. *p ≤ 0,01.

Angesichts des erheblichen Einflusses von XcDSF und BDSF auf die Virulenzkaskade von Shigella fragten wir, ob dies ausreicht, um den invasiven Phänotyp und die Proliferationsfähigkeit in Epithelzellen zu beeinflussen. Wir führten daher einen Gentamicin-Schutz-Infektionstest an einer Monoschicht aus Caco-2-Epithelzellen durch, wobei wir den Shigella-Stamm M90T verwendeten, der in Gegenwart von 0,02 % XcDSF oder BDSF gezüchtet wurde. Während die Infektion 4 Stunden lang andauerte, wurden lebensfähige intrazelluläre Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten (T0 bis T4) durch Lyse der infizierten Monoschichten und Messung der lebensfähigen Bakterienzahl (KBE/ml) bewertet. Dadurch konnten wir die Shigella-Invasion (T0) und ihre intrazelluläre Proliferation (T1 bis T4) berechnen. Der Prozentsatz der M90T-Bakterien, die nach Behandlung mit XcDSF oder BDSF bis T0 in Caco-2-Zellen eindrangen, betrug 24 % bzw. 22 % (Abb. 6A). Was die intrazelluläre Proliferation betrifft, zeigen die Ergebnisse deutlich, dass sich mit XcDSF und BDSF behandelte Shigella-Zellen später in Epithelzellen vermehren als unbehandelte Bakterien, und zwar mit einer Verzögerung von mindestens einer Stunde (Abb. 6B). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit XcDSF und BDSF einen erheblichen Einfluss auf den Eintritt von Shigellen in Epithelzellen hat und somit zu einer Verzögerung der intrazellulären Proliferation führt.

Bewertung des Shigella-Eintritts und der Proliferation in die Epithelzelle. Messung lebensfähiger intrazellulärer S. flexneri-Zellen bei T0 (A) oder über 4 Stunden Inkubation pi (von T0 bis T4) (B). Die Caco-2-Zellinfektion wurde bei MOI 100 mit S. flexneri M90T durchgeführt, das in Abwesenheit (NT) oder mit 0,02 % XcDSF oder BDSF gezüchtet wurde. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen Student-t-Test (A) oder der zweiseitigen Varianzanalyse (ANOVA) (B) ermittelt (p = 0,04). Fehlerbalken stellen die SD dar.

Die mikrobielle Gemeinschaft des menschlichen Darms, auch menschliche „Mikrobiota“ genannt, besteht aus fast 3000 Mikrobenarten, hauptsächlich Bakterien (90 %). Ihre Dichte und Vielfalt nimmt im gesamten Magen-Darm-Trakt zunehmend zu. Die oberen Teile des Darms, der Magen und der proximale Zwölffingerdarm werden normalerweise nur von relativ einfachen mikrobiellen Gemeinschaften besiedelt, die sauren Bedingungen und der Anwesenheit von Gallen- und Pankreasenzymen standhalten können. Eine höhere mikrobielle Dichte und Diversität findet sich im Dickdarm, wo die Transitzeit langsamer ist und die Verfügbarkeit von Nährstoffen größer ist30. Die Darmmikrobiota trägt zu vielen wichtigen Funktionen des menschlichen Körpers bei, einschließlich der Verdauung, der endokrinen Funktion des Darms, der neurologischen Signalübertragung sowie der Bildung und Entwicklung des Immunsystems. Es trägt außerdem zur Integrität der Darmschleimhaut bei, liefert Vitamine und Nährstoffe und wirkt der Besiedlung durch Krankheitserreger entgegen31,32,33. Die bakteriellen Bestandteile der menschlichen Mikrobiota nutzen Quorum Sensing (QS), um miteinander zu kommunizieren. Dieser Mechanismus, der auf der Synthese, Freisetzung, Erkennung und Reaktion auf Signalmoleküle, sogenannte Autoinduktoren, basiert, ermöglicht die Koordination der bakteriellen Aktivitäten im Darm, nicht nur zwischen verschiedenen Mikrobenarten, sondern auch hinsichtlich ihrer Interaktion mit dem Wirt34. Im menschlichen Darm wurden von kommensalen und pathogenen Bakterien produzierte Autoinduktoren identifiziert und mit der Darmgesundheit und -krankheit in Verbindung gebracht35,36. Es hat sich gezeigt, dass von Kommensalbakterien synthetisierte Autoinduktoren dazu beitragen, die Integrität der Darmbarriere aufrechtzuerhalten, Entzündungsprozesse zu modulieren und die „Kolonisierungsresistenz“ zu fördern37, d. Bakteriocin- oder antimikrobielle Peptidproduktion und QS-Interferenz38,39,40. Bakterielle Krankheitserreger nutzen ihre Autoinduktoren, um die Expression von Virulenzfaktoren zu koordinieren und die Wirtsreaktion zu beeinflussen41. Darüber hinaus können bakterielle Krankheitserreger Signalmoleküle aus Wirt und Kommensal abhören, um sich räumlich zu orientieren und die Virulenzexpression an der Infektionsstelle zu optimieren38,42. In dieser Arbeit zeigen wir, dass in Shigella submillimolare Konzentrationen von XcDSF und BDSF, zwei Quorum-Sensing-Signalen, die zur DSF-Familie gehören, eine signifikante Abnahme der virB-Transkription hervorrufen können (Abb. 1). Unsere Beobachtungen (Abb. 2, 3, 5) deuten insbesondere darauf hin, dass dies von der XcDSF- oder BDSF-vermittelten Hemmung der VirF-Aktivierung des virB-Genpromotors abhängt, die aus der direkten Interaktion der beiden DSF-Moleküle mit dem VirF-Protein selbst resultiert. Basierend auf molekularen Modellierungsanalysen schlagen wir außerdem einen Mechanismus vor, bei dem die Bindung von XcDSF oder BDSF an das VirF-Protein dazu führt, dass die VirF-α3-Helix in eine Position geschaltet wird, die keine Dimerisierung mehr zulässt (Abb. 4). Schließlich deuten Ergebnisse von Shigella-Infektionstests an Caco-2-Epithelzellen darauf hin, dass die XcDSF- oder BDSF-vermittelte Unterdrückung der VirF-Aktivität die Shigella-Invasion von Wirtszellen und die intrazelluläre Proliferation signifikant hemmt (Abb. 6). Insgesamt zeigen diese Beobachtungen, dass XcDSF und BDSF, die beiden repräsentativsten QS-Moleküle der DSF-Familie, eine signifikante Antivirulenzwirkung auf Shigella ausüben. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen überein, die zuvor in S. enterica erzielt wurden, wo ein anderes Mitglied der DSF-Familie, cis-2-Hexadecensäure (c2-HDA oder XfDSF2), das HilD-Protein, den wichtigsten Transkriptionsregulator von Salmonellen, bindet und so dessen verhindert Dimerisierung und Aktivität zur Förderung der Transkription und damit Salmonellen-Patogenität15. VirF und HilD gehören zur gleichen Unterklasse des Proteins der AraC-XylS-Familie43 und teilen den durch die Fettsäurebindung vermittelten Hemmmechanismus11,44. Vor diesem Hintergrund und basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit können wir spekulieren, dass andere Verbindungen der DSF-Familie Kandidaten als Inhibitoren von VirF, HilD und sogar für andere Proteine der gleichen AraC-XylS-Unterfamilie, einschließlich ToxT in Vibrio cholerae und, sein könnten Rns in enterohämorrhagischen E. coli (ETEC). Dennoch scheint die Hemmung von der aliphatischen Kettenlänge der DSF-Verbindungen beeinflusst zu werden (Bosire et al.14) und basiert auf den Unterschieden in der Hemmkapazität der Fettsäuren von HilD und VirF (z. B. Palmitoleinsäure)11 ,14, ist die Hemmung der DSF-Moleküle der genannten AraC-XylS-Proteine möglicherweise nicht vollständig vergleichbar. Obwohl die bisher beschriebenen Wechselwirkungen zwischen den Hauptregulatoren der Virulenzmechanismen typischer menschlicher Enteropathogene darauf hindeuten, dass die DSF-Moleküle im menschlichen Darm vorhanden sind, wird dies immer noch diskutiert. Dennoch stützen einige zusätzliche Beweise diese Präsenz. Insbesondere die Identifizierung des DSF-Produzenten Stenotrophomonas maltophilia als Teil der zentralen Krypta-spezifischen Mikrobiota des Mäusedarms45,46 und die Bewertung von cis-2-Hexadecensäure (c2-HDA) als eines der am häufigsten vorkommenden Moleküle im Mäusedarm Der Fettsäureanteil im Dickdarminhalt von Mäusen15 zeigt, dass DSFs im Darm von Mäusen vorhanden sind, und legt nahe, dass sie möglicherweise auch im Darm anderer Säugetiere, einschließlich des Menschen, vorhanden sind. Darüber hinaus haben In-silico-Vorhersagen die Existenz genetischer DSF-Schaltkreise in vielen menschlichen Darmmikroorganismen gezeigt47,48. Zusammenfassend können wir angesichts des wahrscheinlichen Vorhandenseins von DSFs im menschlichen Darm spekulieren, dass DSFs zur „Kolonisierungsresistenz“ beitragen könnten, indem sie die Virulenz von Krankheitserregern wie V. cholerae, S. enterica und S. flexneri hemmen15. Alternativ könnten DSFs an der Feinabstimmung der Virulenzexpression in Enteropathogenen beteiligt sein, indem sie die vollständige Expression von Virulenzsystemen im Darmlumen verhindern, wo DSFs möglicherweise in höheren Konzentrationen vorhanden sind, und ihre Expression ermöglichen, wenn sich das Bakterium der Darmschleimhaut, dem Lumen, nähert Verbindungen sind in geringeren Konzentrationen vorhanden12. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass Shigella, wenn sie sich der Darmschleimhaut nähert, nicht nur eine Abnahme der Konzentration von DSF-Molekülen erfährt, was zu einer Derepression der Virulenz führt, sondern auch eine Zunahme der Sauerstoffversorgung abhängig von der Anwesenheit von DSF-Molekülen wahrnimmt das Kapillarnetz in der Schleimhaut. Dies führt zu einer vollständigen Aktivierung des T3SS und erhöht so die Virulenz49. Wir können daher die Hypothese aufstellen, dass die Verdünnung der DSF-Moleküle und die Erhöhung des Sauerstoffs zusammenwirken, um die Expression der Shigella-Virulenz am richtigen Wirkort zu optimieren. Insgesamt kann die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen VirF- und DSF-Molekülen zur rationalen Entwicklung innovativer Verbindungen beitragen, die eine Antivirulenzaktivität aufweisen, indem sie gezielt auf die bakterielle Virulenz abzielen, ohne das Zellwachstum zu beeinträchtigen. Dies könnte zu anderen therapeutischen Strategien als dem Einsatz von Antibiotika bei der Behandlung von Shigellose führen und so den alarmierenden Anstieg antibiotikaresistenter Shigella-Stämme, die in den letzten Jahren isoliert wurden, eindämmen50.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle S1 aufgeführt. Bakterienzellen wurden aerob in Luria-Bertani (LB)-Medium (Sigma-Aldrich) bei 37 °C gezüchtet und bei Bedarf wurden Antibiotika in den folgenden Endkonzentrationen zugesetzt: Ampicillin 100 μg/ml; Kanamycin 30 μg/ml; Streptomycin 10 μg/ml. Um die Wirkung von XcDSF und BDSF (Sigma-Aldrich) auf das Bakterienwachstum zu bewerten, wurde eine 5 %ige Lösung dieser Verbindungen durch Erhitzen des Röhrchens auf 37 °C und Schütteln im Ultraschallbad erhalten. Diese Lösung wurde dann auf die angegebenen Endkonzentrationen in LB-Medium verdünnt, wobei darauf geachtet wurde, die DMSO-Konzentration (4 %) in jeder Probe konstant zu halten. Um die anderen In-vivo- und In-vitro-Experimente durchzuführen, verwendeten wir eine 2 %ige Lösung von XcDSF oder BDSF in DMSO, die dann in LB oder in einem speziellen Puffer auf eine Endkonzentration von 0,02 % verdünnt wurde. Die Oligonukleotidsequenzen, die auf der Grundlage des M90T-Genoms entworfen wurden, sind in Tabelle S2 aufgeführt. PCR-Reaktionen wurden routinemäßig mit der DreamTaq-DNA-Polymerase (Thermo Fisher Scientific) oder bei Bedarf mit einem PCR-Produkt mit höherer Genauigkeit, der Ex Taq-DNA-Polymerase (Takara) durchgeführt. Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in Tabelle S3 aufgeführt.

Die bakterielle RNA-Reinigung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt51 und die cDNA-Synthese wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Kurz gesagt, 1,5 μg Gesamt-RNA von Bakterien wurden mit DNAse I behandelt und dann in einem 20 μl-Reaktionsgemisch gemäß den Anweisungen des Herstellers retrotranskribiert. Die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (qRT-PCR) wurde auf einem StepOnePlus™ Real-Time-PCR-System (Applied Biosystem) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug 20 μl und enthielt Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem), 2 μl cDNA-Probe und spezifische Oligos für die Gene virF, virB, icsA und nusA (jeweils 300 nM), wobei das letzte als endogene Kontrolle verwendet wurde . Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 1 Zyklus 95 °C für 2 Minuten, 40 Zyklen 95 °C für 10 Sekunden, gefolgt von 60 °C für 30 Sekunden. Die quantitative Analyse der Transkripte basierte auf der 2-ΔΔCt-Methode52 und die Ergebnisse werden als „relativer Ausdruck“ zur Referenzprobe angegeben. Alle für die qRT-PCR verwendeten Oligopaare, die mit der Primer Express-Software v2.0 entwickelt wurden, sind in Tabelle S2 aufgeführt und wurden experimentell validiert.

Bakterienpellets wurden in PBS mit 1X Final Sample Buffer (FSB) resuspendiert und nach Kochen bei 100 °C auf 12,5 % SDS-PAGE geladen. In jedem Elektrophoreselauf war ein Protein-Molekulargewichtsmarker (Page Ruler; Thermo Fisher) enthalten. Die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen (Hybond-P, Millipore) übertragen und das Immunblotting wurde mit monoklonalem ANTI-FLAG® M2-Antikörper (Sigma-Aldrich) und polyklonalem Kaninchen-Anti-OmpA53,54 als primären Antikörpern und HRP-konjugiertem Ziegen-Antikörper durchgeführt -Maus- und Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als Sekundärantikörper (Sigma-Aldrich). Die Signale wurden mit ECL Star (Euroclone) erzeugt und mit dem ChemiDoc™ Gel Imaging System (Bio-Rad Laboratories) nachgewiesen. Die densitometrische Analyse wurde mit der ImageJ-Software55 durchgeführt.

Übernachtkulturen von E. coli XL1BLUE pMALcF1 wurden 100-fach in 1 l LB-Medium mit 0,2 % Glucose verdünnt und bei 37 °C inkubiert. Glukose war notwendig, um Maltose-Chromosomengene zu unterdrücken und die Expression von Amylase und damit den Amyloseabbau auf Affinitätsharz zu verhindern. Als die Kulturdichte eine OD600 von 0,5 erreichte, wurden 0,3 mM IPTG zugegeben, um die Transkription des malE-virF-Gens zu induzieren, und die Inkubation wurde weitere 4 Stunden bei 37 °C fortgesetzt. Durch Zentrifugation geerntete Zellen wurden in 10 ml Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA und 200 mM NaCl) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung auf Eis aufgebrochen und 20 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde fünffach mit Puffer A verdünnt und auf eine 5-ml-Säule aus Amyloseharz (New England Biolabs), voräquilibriert in Puffer A, mit einer Flussrate von 1 ml/min geladen. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer A gewaschen und das Fusionsprotein wurde mit 20 ml Puffer A, der 10 mM Maltose enthielt, eluiert. Fraktionen, die MalE-VirF enthielten, wurden gemäß SDS-PAGE-Analyse gepoolt, gewaschen (um Maltose zu entfernen) und mit Filtervorrichtungen mit 50 kDa MWCO (Millipore) konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines theoretischen Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 89.730 M−1 cm−1 berechnet (berechnet mit dem Expasy ProtParam-Tool).

Der DPIPA-Assay11 nutzt die mit Dextrin beschichtete Oberfläche von Polystyrol-Mikroplattenvertiefungen mit flachem Boden (Nunc MaxisorpTM, Thermo Fisher Scientific) als feste Matrix für die Affinitätsadsorption des MalE-VirF-Proteins. Dies wurde dann verwendet, um die Menge des PvirB-DNA-Fragments zu messen, das die proximale VirF-Bindungsstelle auf der virB-Promotorsequenz24 umfasst und durch PCR-Amplifikation unter Verwendung des pvirB_F FITC/pvirB_R FITC-Oligopaars und des pBN1-Plasmids als Matrize erhalten wurde. Kurz gesagt, 96 Plattenvertiefungen wurden mit 150 μl 0,5 % Gew./Vol. Dextrin aus Maisstärke (Sigma-Aldrich), gelöst in 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 (PBS), über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer behandelt. Anschließend wurden die Vertiefungen 1 Stunde lang mit 150 μl 1,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS bei 37 °C blockiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden 50 μl Bindungspufferlösung (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,1 % NP-40) mit 1 μM MalE-VirF-Protein und 75 ng FITC-markierter PCR hinzugefügt DNA-Fragmente und bei Bedarf 0,02 % XcDSF oder BDSF wurden in die Vertiefungen gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Abschließend wurde der Überstand entfernt und die Fluoreszenz der gebundenen DNA mit dem CLARIOstar-Mikroplattenlesegerät (BMG LABECH, Offenburg, Deutschland) nachgewiesen.

Modellierungs- und Andockvorgänge wurden wie bereits beschrieben11 durchgeführt. Kurz gesagt, das dimere Modell von VirF wurde unter Verwendung von AlphaFold2 (Version 2.0.1)56 mit dem templatbasierten homologen Transkriptionsregulator Rns (https://www.rcsb.org/; PDB-Zugangsnummer 6XIU; Prozentsatz der Identität, 41 %) erhalten. )13. Das Andocken von DSF an das aktive Zentrum wurde mit der Molegro Virtual Docker (MVD)-Software v7.0 (Molexus) durchgeführt. Die DNA-Bindung von VirF wurde anhand der Struktur von Mar-A (PDB: 1XS954) als Matrize vorhergesagt. Strukturmodellierung und -analyse wurden mit PyMod 3.057 durchgeführt. Die Konformationsübergänge von VirF zwischen der offenen und der geschlossenen Konformation wurden mithilfe des in PyANM58 implementierten Elastic Network Model mit Standardwerten ermittelt.

Infektionsexperimente wurden unter Verwendung von Caco-2-Zelllinien wie zuvor beschrieben durchgeführt59. Menschliche Caco-2-Epithelzellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten 5 % CO2-Atmosphäre in DF10 gezüchtet, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum FBS (FBS), 2 mM l, enthält -Glutamin und 10 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (PS) (Sigma-Aldrich) in Dulbecco-modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) (GIBCO). Zur bakteriellen Infektion wurden Zellen in 6-Well-Gewebekulturplatten (Falcon) mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen/Well in DF10 ausgesät. Nach 24 Stunden wurde den Zellen über Nacht in einem modifizierten DF10-Medium mit 0,5 % FBS (DF0,5) das Serum entzogen. DF0,5 wurde 2 Stunden vor der bakteriellen Infektion durch frisches DMEM ersetzt, das nur L-Glutamin enthielt. Die Zelllinie wurde mit einer MOI von 100 infiziert. Nach der Zugabe von unbehandelten und 0,02 % XcDSF- oder BDSF-behandelten Bakterien wurden die Platten 15 Minuten lang bei 750 × g zentrifugiert und 45 Minuten lang bei 37 °C unter 5 % CO2-Atmosphäre, um das Eindringen von Bakterien zu ermöglichen. Anschließend wurden extrazelluläre Bakterien durch vollständiges Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Dieser Punkt wurde als Zeitpunkt Null (T0) betrachtet. Zu jeder Platte wurde frisches DMEM-Medium mit Gentamicin (100 μg/ml) gegeben, um extrazelluläre Bakterien abzutöten, und die infizierten Zellen wurden bis zu 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Um die Anzahl der intrazellulären Bakterien für alle Infektionszeiten zu berechnen, wurden die Zellen lysiert und die Bakterien gewonnen, mit 0,9 % NaCl gewaschen und seriell auf LB-Agar verdünnt. Der Prozentsatz der Bakterien, die in Caco-2-Epithelzellen eingedrungen sind, wurde berechnet, indem die KBE/ml zum Zeitpunkt T0 mit denen verglichen wurden, die durch Ausplattieren der zur Infektion der Epithelzellen verwendeten Bakterienlast (d. h. der bakteriellen Vorinfektionskontrolle) erhalten wurden. Das Überleben der Bakterien wurde durch Berechnung der über 4 Stunden pi (T0–T4) erhaltenen KBE/ml analysiert.

Die statistische Signifikanz wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test in RT-PCR-Experimenten, der densitometrischen Analyse von Western Blot und DPIPA bestimmt. Die bidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse hinsichtlich der Invasionsfähigkeit von Shigella in Caco-2-Zellen zu berechnen.

Die im Rahmen dieser Studie analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Isabel Delany für die wertvolle Überarbeitung dieses Artikels.

Die Finanzierung wurde vom italienischen Ministerium für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, JP21GR04, Universität Sapienza Rom, unterstützt.

Institut Pasteur Italia, Abteilung für Biologie und Biotechnologie „Charles Darwin“, Universität Sapienza Rom, p.le Aldo Moro 5, 00185, Rom, Italien

Rita Trirocco, Martina Pasqua, Bianca Colonna und Gianni Prosseda

Institut für Molekularbiologie und Pathologie, Nationaler Forschungsrat, Rom, Italien

Angela Tramonti

Abteilung für Biochemische Wissenschaften, Universität Sapienza Rom, p.le Aldo Moro 5, 00185, Rom, Italien

Alessandro Paiardini

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Konzeptualisierung, GP, RT; Methodik, Untersuchung, formale Analyse und Datenkuration, GP, RT, AT, AP, MP; Schreiben des Originalentwurfs, GP, BC, AP, MP, Schreiben von Rezensionen und Bearbeiten, BC, GP; Projektverwaltung, GP, BC Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Gianni Prosseda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Trirocco, R., Pasqua, M., Tramonti, A. et al. Diffusionsfähige Signalfaktoren (DSFs) binden und unterdrücken VirF, den führenden Virulenzaktivator von Shigella flexneri. Sci Rep 13, 13170 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40023-w

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Eingegangen: 29. Mai 2023

Angenommen: 03. August 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40023-w

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