Erzeugung eines rekombinanten Saffold-Virus, das UnaG als Marker zur Visualisierung einer Virusinfektion exprimiert

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 175 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Saffold-Virus (SAFV), das zur Gattung Cardiovirus der Familie Picornaviridae gehört, wird bei Kindern mit akuten Atemwegs- oder Magen-Darm-Erkrankungen in Verbindung gebracht; Es besteht auch der Verdacht, dass es schwere Krankheiten wie akute schlaffe Lähmungen und aseptische Meningitis verursachen kann. Allerdings ist das Verständnis des Mechanismus seiner Pathogenität aufgrund der vielen Unbekannten über seinen Lebenszyklus noch begrenzt; Beispielsweise muss noch der zelluläre Rezeptor für seine Infektion bestimmt werden. Um die Forschung zu SAFV zu beschleunigen, ist ein System zur Überwachung der SAFV-Infektion in vitro und in vivo erforderlich.

Wir haben ein rekombinantes SAFV erzeugt, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder UnaG exprimiert, ein neuartiges fluoreszierendes Protein, das aus japanischem Aal stammt. HeLa-Zellen, die entweder mit GFP oder UnaG-exprimierendem SAFV infiziert waren, zeigten ein hellgrünes Fluoreszenzsignal, was eine bequeme Überwachung der SAFV-Infektion ermöglichte. Allerdings ging die Expression von GFP, jedoch nicht von UnaG, während der Viruspassage aufgrund der unterschiedlichen genetischen Stabilität im SAFV-Virusgenom schnell verloren; das UnaG-Gen blieb nach mindestens fünf Passagen stabil im Virusgenom erhalten.

Die SAFV-Infektion kultivierter Zellen kann leicht mit UnaG-exprimierendem SAFV überwacht werden, das GFP hinsichtlich der genetischen Stabilität im Virusgenom überlegen ist. Dieses Virus könnte ein nützliches Instrument für die SAFV-Forschung sein, beispielsweise zum Vergleich der Anfälligkeit verschiedener Zellen gegenüber einer SAFV-Infektion und zur Bewertung der Auswirkungen antiviraler Medikamente auf die SAFV-Infektion im Hochdurchsatz-Screening.

Das Saffold-Virus (SAFV) gehört zur Gattung Cardiovirus der Familie Picornaviridae, einem kleinen, nicht umhüllten und ikosaedrischen Partikel mit einem einzelsträngigen RNA-Genom mit positivem Sinn. SAFV wurde 2007 als erstes menschliches Kardiovirus im Stuhl eines Säuglings entdeckt, der 1981 Fieber unbekannter Ursache aufwies [1]. Seitdem wurde über den Nachweis von SAFV bei Kindern mit akuten Atemwegs- oder Magen-Darm-Erkrankungen berichtet [2,3,4,5,6]. Darüber hinaus wurden SAFVs in Proben von Patienten mit schwerer Erkrankung (z. B. akuter schlaffer Lähmung, aseptischer Meningitis, Myokarditis, akuter Pankreatitis und Kleinhirnentzündung) nachgewiesen [7,8,9,10,11]. Allerdings bleibt die Pathogenität von SAFV, das eine Vielzahl leichter bis schwerer Symptome verursacht, unklar. Die Verwendung eines rekombinanten SAFV, das ein Reportergen wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) enthält und eine bequeme Echtzeitüberwachung der SAFV-Replikation in vitro und in vivo ermöglicht, wäre für die Aufklärung des Mechanismus der SAFV-Pathogenität von großem Nutzen.

Das SAFV-Genom besteht aus einem langen offenen Leserahmen (ORF), 5'- und 3'-untranslatierten Regionen (UTR) und einem Poly(A)-Schwanz variabler Länge am 3'-UTR. Der ORF kodiert für ein Leitprotein (L), vier Kapsidproteine (VP1 bis VP4) und sieben nichtstrukturelle Proteine (2 A, 2B, 2 C, 3 A, 3B, 3 C und 3D) [1]. Polyprotein wird aus dem ORF übersetzt und dann von der 3 C-Protease posttranslational zu reifen viralen Proteinen verarbeitet, während die cotranslationale Trennung des Polyproteins am StopGo-Motiv erfolgt. Dieses Motiv ist das Oligopeptid D(V/I) ExNPG|P (wobei das „|“ die Verbindung zwischen 2 A und 2B darstellt), das den StopGo-Prozess vermittelt [12, 13] und in der 2 A/2B-Verbindung von SAFV konserviert ist (DIETNPG|P) [14]. Der StopGo-Prozess wird auch als „ribosomales Skipping“ oder „Stop-Carry On“ bezeichnet und verhindert die Bildung einer Peptidbindung zwischen Glycin und Prolin, ermöglicht aber die Fortsetzung der Translation.

Um die molekularpathogenetischen Studien von SAFV mittels Reverse Genetik voranzutreiben, haben wir zuvor einen infektiösen cDNA-Klon von SAFV-3 (dem Stamm JPN08-404) etabliert [8]. In der vorliegenden Studie haben wir auf der Grundlage dieses cDNA-Klons zwei rekombinante SAFVs generiert, die ein Reportergen, GFP oder UnaG, exprimieren, um Infektionen in lebenden Zellen leicht zu erkennen, indem wir sie mithilfe des StopGo-Motivs zwischen 2 A und 2B eingefügt haben. UnaG ist ein neuartiges grün fluoreszierendes Protein aus japanischem Aal [15], das mit 139 Aminosäuren im Vergleich zu GFP (239 Aminosäuren) kleiner ist. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass UnaG im Hinblick auf die genomische Stabilität des Virusgenoms ein überlegener Marker für eine SAFV-Infektion gegenüber GFP ist. Wir zeigen außerdem den Nutzen von UnaG-exprimierendem SAFV für die Untersuchung von SAFV-Infektionen und das Screening antiviraler Medikamente.

Um einen Reporter-exprimierenden rekombinanten SAFV-Genotyp 3 (SAFV-3) zu erzeugen, haben wir ein GFP- oder UnaG-Gen mit zwei StopGo-Motiven an beiden 5'- und 3'-Enden in die cDNA voller Länge von SAFV-3 (JPN08-) eingefügt. 404-Stamm) [8]. Dies soll die Translation fluoreszierender Proteine ohne Verlust viraler Proteine ermöglichen. Wir hielten die Insertion von Reportergenen zwischen 2A und 2B unter Verwendung des StopGo-Motivs aus folgenden Gründen für überlegen gegenüber anderen Methoden, wie z. B. deren Insertion in 3'-UTR oder 5'-UTR: Erstens die genaue Sequenz, die vom SAFV 3 erkannt wird C-Protease, die für die Trennung von Reporterproteinen vom viralen Polyprotein beim Einbau in die 3'-UTR oder 5'-UTR notwendig ist, war unbekannt. Zweitens könnte das Einfügen der Reportergene in die 3'-UTR möglicherweise zu einer verringerten Produktion von Reporterproteinen führen, da die Translation viraler Proteine stromabwärts von 2B bei Kardioviren gering ist [16, 17]. Wir haben diesen cDNA-Klon des GFP- und UnaG-exprimierenden rekombinanten SAFV-3 als pSAF/GFP bzw. pSAF/UnaG bezeichnet (Abb. 1A). Anschließend wurde die infektiöse RNA in vitro aus NotI-linearisiertem pSAF/GFP und pSAF/UnaG transkribiert und in BHK-21-Zellen transfiziert, um das GFP- und UnaG-exprimierende rekombinante SAFV-3 (SAF/GFP und SAF/UnaG) zu erzeugen. . Die transfizierten Zellen zeigten eindeutig eine vergleichbare Expression von GFP und UnaG und einen vergleichbaren zytopathischen Effekt (CPE) (Abb. 1B und Daten nicht gezeigt). Um die Produktion infektiöser rekombinanter Viren zu bestätigen, inokulierten wir HeLa-Zellen mit Zellkulturüberständen von infektiösen RNA-transfizierten BHK-21-Zellen, die Passage 0 (P0)-Viren enthielten. Die inokulierten HeLa-Zellen zeigten die Expression von GFP und UnaG sowie das Auftreten von CPE, was die Produktion von infektiösem SAF/GFP und SAF/UnaG bestätigte (Abb. 1C). Beim Vergleich der Fluoreszenzintensität infizierter Zellen zeigten SAF/UnaG-infizierte Zellen einen etwas niedrigeren mittleren Fluoreszenzintensitätswert (48,32) im Vergleich zu SAF/GFP-infizierten Zellen (57,82). Allerdings zeigten sie konsistentere Signale als GFP, was bei der Bestimmung einer Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie als vorteilhaft angesehen wird. Somit zeigten diese Ergebnisse, dass sowohl UnaG als auch GFP als fluoreszierendes Reporterprotein zur Visualisierung einer SAFV-3-Infektion verwendet werden können.

Erzeugung von Reporter-exprimierendem SAFV-3. (A) Ein schematisches Diagramm der Einfügung von fluoreszierendem Protein in das SAFV-Genom und der Erzeugung des Reporter-exprimierenden Virus. Ein fluoreszierendes Proteingen (UnaG oder GFP) mit StopGo-Motiven am 5'- und 3'-Ende wurde zwischen 2 A und 2B von pSAF404 eingefügt. Die resultierenden Konstrukte (pSAF/UnaG und pSAF/GFP) wurden mit NotI linearisiert und RNA wurde aus dem T7-Promotor durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Pfeilspitzen zeigen die Trennstelle durch StopGo während der Übersetzung an. Unterstrichene Peptide stellen StopGo-Motive dar. Peptidsequenzen, die an beiden Enden des fluoreszierenden Proteins hinzugefügt wurden, sind rot dargestellt. (B) BHK-21-Zellen, transfiziert mit RNA-Transkripten, die aus pSAF404, pSAF/GFP und pSAF/UnaG durch CUGA 7-RNA-Polymerase synthetisiert wurden. 20 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen und Überstände, die rekombinante Viren enthielten, geerntet. Bilder transfizierter Zellen wurden vor der Ernte mit einem JULI™ Smart Fluoreszenzzellanalysator fotografiert. Maßstabsbalken, 200 μm. (C) HeLa-Zellen, die mit P0-SAF/GFP- oder SAF/UnaG-Viren infiziert waren, wurden 16 Stunden nach der Infektion fotografiert. Dargestellt sind die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität und SD. Maßstabsbalken, 100 μm. Die Grafik stellt die Fluoreszenzintensität von 50 Zellen dar. Die roten horizontalen Balken geben die Mittelwerte an. Die statistische Analyse wurde mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test (*p = 0,0418) durchgeführt.

Während des Passageprozesses zur Vermehrung von SAF/GFP- und SAF/UnaG-Virusbeständen beobachteten wir einen schnellen Verlust der GFP-Expression, nicht jedoch der UnaG-Expression in infizierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Wir führten den Verlust des GFP-Signals während der Passage auf den Verlust des GFP-Gens im Genom zurück. Daher untersuchten wir die genetische Stabilität der GFP- und UnaG-Gene im SAFV-3-Genom mittels RT-PCR. Nach der anfänglichen Wiederherstellung der P0-SAF/GFP- und SAF/UnaG-Viren haben wir diese Viren fünfmal seriell in HeLa-Zellen passagiert und P1-, P3- und P5-SAF/UnaG- sowie P3-SAF/GFP-Virusbestände hergestellt. Die RT-PCR dieser Bestände ergab, dass das exogene GFP-Gen instabil war und aus dem SAFV-3-Genom ausgeschieden wurde; Das GFP in voller Länge wurde nach drei Passagen überhaupt nicht nachgewiesen (Abb. 2A). Im Gegensatz dazu war das UnaG-Gen stabil und blieb über mindestens fünf Passagen im SAFV-3-Genom erhalten (Abb. 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass rekombiniertes GFP-Null-SAFV-3 auftauchte und SAF/GFP während der Passage verdrängte, wahrscheinlich aufgrund des Wachstumsnachteils von SAF/GFP. Andererseits könnte die relativ geringe Größe von UnaG dazu beitragen, dass es während der Passage stabil im SAFV-3-Genom verbleibt. Dies steht im Einklang mit einem früheren Bericht, der zeigt, dass das Mengovirus, ein weiteres Kardiovirus, exogene Gene mit < 500–600 Basen stabil beherbergen kann, wenn es zwischen 2A und 2B mit ähnlichen StopGo-Motiven eingefügt wird [18].

Genetische Stabilität der SAF/GFP- und SAF/UnaG-Genome. Um die genetische Stabilität der Gene GFP (A) und UnaG (B) im SAFV-3-Genom zu untersuchen, wurden SAF/GFP- oder SAF/UnaG-Viren seriell in Hela-Zellen passagiert. Genomische RNAs wurden aus den geklärten Überständen von SAF/GFP (P3) und SAF/UnaG (P1, P3 und P5) extrahiert, gefolgt von RT-PCR. Die Inserts voller Länge wurden unter Verwendung von pSAF/GFP und pSAF/UnaG als Matrizen amplifiziert (Spur C). Die Positionen der Größenmarkierungen werden links von jedem Feld angezeigt

Um zu untersuchen, ob die Insertion des exogenen UnaG-Gens in das Virusgenom die Effizienz der Virusreplikation beeinflussen würde, wurde die Wachstumskinetik des SAF/UnaG-Virus durch einen Standard-Plaque-Assay unter Verwendung von HeLa-Zellen analysiert (Abb. 3). Der Titer des SAF/UnaG-Virus erreichte 24 Stunden nach der Infektion seinen Höhepunkt, ähnlich wie beim rekombinanten Wildtyp-SAFV-3-Virus (SAF404). Darüber hinaus ähnelte die Wachstumskinetik des SAF/UnaG-Virus früheren Daten, die vom Elternstamm JPN08-404 und dem von cDNA abgeleiteten SAF404 erhalten wurden [8]. Somit zeigten diese Ergebnisse, dass die Insertion eines Reportergens zwischen 2 A und 2B mit StopGo-Motiven den Replikations- und Infektionszyklus des rekombinanten SAFV-3 nicht stört. Zusammen mit der Stabilität des UnaG-Gens im SAFV-3-Genom deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das UnaG-exprimierende rekombinante SAFV-3 ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung einer SAFV-3-Infektion in experimentellen Umgebungen sein könnte.

Wachstumskurve von SAF/UnaG in HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit rekombinantem Wildtyp-SAFV-3 (SAF404) oder SAF/UnaG bei einer MOI von 5 infiziert. Die Kulturüberstände (offener Kreis) und Zellen (geschlossener Kreis) wurden zu den angegebenen Zeiten gesammelt und durch einen Standard-Plaque-Assay titriert auf HeLa-Zellen. Die angegebenen Titer sind der Mittelwert ± Standardabweichung in drei unabhängigen Experimenten

Um den Nutzen von SAF/UnaG zu überprüfen, infizierten wir zunächst HeLa- und BHK-21-Zellen mit SAF/UnaG und verglichen die CPE- und Fluoreszenzsignale in diesen Zellen. Unsere früheren Studien haben berichtet, dass HeLa-Zellen sehr anfällig für eine SAFV-3-Infektion sind [19, 20]. Bei der Infektion von HeLa-Zellen mit dem SAF/UnaG-Virus wurde beobachtet, dass der CPE dem des Wildtyp-Virus und dem UnaG-Fluoreszenzsignal in infizierten Zellen ähnelte (Abb. 4A). Obwohl mit der infektiösen RNA von SAFV-3 transfizierte BHK-21-Zellen in der Lage waren, virale Nachkommen zu produzieren (Abb. 1B), zeigten mit dem SAF/UnaG-Virus inokulierte BHK-21-Zellen nur sporadische fluoreszierende Zellen und keinen Anstieg der UnaG-Expression oder das CPE, was darauf hinweist, dass SAFV-3 keine BHK-21-Zellen infiziert hat (Abb. 4B). Daher sind BHK-21-Zellen für eine SAFV-3-Infektion unempfindlich, was wahrscheinlich auf das Fehlen von SAFV-Rezeptoren zurückzuführen ist.

Anfälligkeit von Zelllinien für eine SAFV-Infektion. (A) HeLa-Zellen wurden mit SAF/UnaG oder rekombinantem Wildtyp-SAFV-3 (SAF404) bei einer MOI von 10 infiziert. Die UnaG-Fluoreszenz (grün, linkes Feld) und das CPE wurden 24 Stunden nach der Infektion fotografiert. (B) BHK-21-Zellen wurden mit SAF/UnaG bei einer MOI von 10 infiziert. UnaG-Fluoreszenz (grün, linkes Feld) und CPE wurden 24 Stunden nach der Infektion fotografiert. (C und D) Zellen wurden mit SAF/UnaG (C) oder SAF404 (D) bei einer MOI von 1 infiziert und 16 Stunden nach der Infektion für HeLa fotografiert (C) oder mit Anti-SAFV3-Antiserum (D) gefärbt. Caco-2- und HMV-II-Zellen und 50 Stunden nach der Infektion für U2OS-, HCT116-, BHK-21-, CHO-K1- und RAW264.7-Zellen. Der Prozentsatz infizierter Zellen wurde nach der Untersuchung von mindestens 800 Zellen bestimmt. Maßstabsbalken, 200 μm

Wir untersuchten weiter die Anfälligkeit anderer Zelllinien von Menschen und Nagetieren, indem wir sie mit einer gleichen Menge SAF/UnaG infizierten. oder SAF404 und Bewertung der Expression von UnaG bzw. SAFV-Antigen (Ag). Der Prozentsatz der UnaG-positiven Zellen zeigte eine starke Korrelation mit dem der SAFV-Ag-positiven Zellen (Abb. 4 C und D), was darauf hindeutet, dass das SAF/UnaG-Virus als brauchbarer Ersatz für SAFV bei der Bewertung der Effizienz einer SAFV-Infektion dienen kann . Unter den getesteten menschlichen Zelllinien zeigten Caco-2, U2OS und HMV-II eine Anfälligkeit, wobei HMV-II-Zellen die höchste Anfälligkeit aufwiesen. Umgekehrt beobachteten wir eine minimale UnaG-Expression, konnten jedoch eine kleine Anzahl SAFV-Ag-positiver Zellen in HCT116-Zellen nachweisen (Abb. 4 C und D), was auf deren geringe Anfälligkeit für SAFV-3 schließen lässt. Die Diskrepanz zwischen UnaG und SAFV Ag kann auf die höhere Empfindlichkeit des SAFV Ag-Nachweises durch Immunfluoreszenz in Zellen mit geringer Anfälligkeit zurückgeführt werden. In den Nagetierzelllinien RAW264.7 und CHO-K1 wurden sporadisch UnaG-exprimierende Zellen beobachtet, die Expression von UnaG und SAFV Ag breitete sich jedoch nicht auf die umgebenden Zellen aus (Abb. 4 C und D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nagetierzellen nicht anfällig für eine SAFV-3-Infektion sind und dass zwischen menschlichen Zelllinien ein Unterschied in der SAFV-3-Anfälligkeit besteht. Es wäre interessant zu wissen, ob dieser Unterschied in menschlichen Zellen auf Unterschiede in der Expression viraler Infektionsrezeptoren zurückzuführen ist, die derzeit nicht identifiziert werden, oder auf Wirtsfaktoren, die an anderen Prozessen wie der Virusreplikation beteiligt sind.

Als nächstes untersuchten wir die potenzielle Verwendung von SAF/UnaG für die Forschung zur Entdeckung antiviraler Arzneimittel am Beispiel von Pleconaril. Pleconaril ist ein Anti-Picornaviral-Wirkstoff, der an die hydrophobe Tasche im Kapsidprotein VP1 bindet und dadurch die Virusanheftung an Wirtszellen und Konformationsänderungen verhindert, die für die virale Enthüllung bei Enteroviren und Rhinoviren erforderlich sind [21]. Pleconaril zeigt ein breites Wirkungsspektrum gegen Enteroviren und Rhinoviren, die Empfindlichkeit von SAFV-3 gegenüber Pleconaril ist jedoch unbekannt, da SAFV-3 VP1 die hydrophobe Tasche fehlt [22]. Wir haben daher die antivirale Wirkung von Pleconaril auf SAFV-3 anhand des SAF/UnaG-Virus untersucht. Wir haben SAF/UnaG mit steigenden Mengen Pleconaril und infizierten HeLa-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 vorbehandelt, dann die Zellen gewaschen und weitere 16 Stunden in frischem Medium inkubiert. 19 Stunden nach der Infektion, als der CPE immer noch nicht beobachtet wurde, bewerteten wir die antivirale Wirkung von Pleconaril, indem wir die Anzahl der UnaG-positiven Zellen untersuchten. Wir fanden heraus, dass Pleconaril die Anzahl der UnaG-positiven Zellen bei Konzentrationen von 40 und 50 µg/ml verringerte, was zeigt, dass Pleconaril die SAFV-3-Infektion in HeLa-Zellen hemmt (Abb. 5). Darüber hinaus ließ sich die antivirale Wirkung von Pleconaril leicht anhand der UnaG-Fluoreszenz bewerten, was beispielsweise ein Anti-SAFV-Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegeräts ermöglichen würde.

Antivirale Wirkung von Pleconaril bei SFV/UnaG-Infektion. SAF/UnaG wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den angegebenen Pleconaril-Konzentrationen vorbehandelt. HeLa-Zellen wurden mit dem vorbehandelten SAF/UnaG bei einer MOI von 1 (1,25 × 105 PFU/Well) infiziert. Die Zellen wurden 19 Stunden nach der Infektion fotografiert. Die antivirale Wirkung von Pleconaril wurde anhand der Anzahl der UnaG-exprimierenden Zellen 19 Stunden nach der Infektion bewertet. In keiner der Vertiefungen wurde eine Zytotoxizität von DMSO oder Pleconaril beobachtet

Was den Mechanismus der Pleconaril-Wirkung auf SAFV-3 betrifft, so haben Mullapudi et al. berichteten, dass der Raum zwischen den beiden β-Faltblättern von VP1, der bei einigen Enteroviren einen hydrophoben Hohlraum mit einem Taschenfaktor enthält, mit den Seitenketten von Aminosäureresten gefüllt ist, die den Proteinkern in SAFV-3 bilden, und stellten fest, dass dies der Fall ist Es ist unwahrscheinlich, dass Taschenbindungsinhibitoren wie Pleconaril zur Hemmung einer SAFV-Infektion eingesetzt werden könnten [22]. In der vorliegenden Studie hemmte jedoch die Vorbehandlung mit Pleconaril die SAFV-3-Infektion, was darauf hindeutet, dass die Virusanhaftung und/oder -ablösung ähnlich wie bei Enteroviren verhindert werden kann. Das Pleconaril kann möglicherweise die sterische Hinderung durch die CD-Schleife umgehen und an die Tasche binden.

Wir haben ein rekombinantes SAFV-3 generiert, das GFP oder UnaG als Reportergen exprimiert, und gezeigt, dass UnaG aufgrund seiner genetischen Stabilität während der Passage ein überlegener Marker gegenüber GFP ist. Wir haben auch gezeigt, dass das SAF/UnaG-Virus ein nützliches Instrument zum Vergleich der SAFV-Anfälligkeit in verschiedenen Zelllinien und zur Bewertung der Wirkung antiviraler Medikamente auf eine SAFV-Infektion ist. Kürzlich wurde UnaG verwendet, um mehrere Reporter-exprimierende rekombinante Viren zu erzeugen, wie zum Beispiel Rotavirus in Form des NSP3-UnaG-Fusionsproteins und Adeno-assoziiertes Reportervirus [23, 24]. Somit wird UnaG zusätzlich zu SAFV und anderen Viren der Picornaviridae-Familie zu einem vielversprechenden Reporterprotein für die Visualisierung der Infektion einer Vielzahl von Viren; UnaG-exprimierende rekombinante Viren werden ein wertvolles Instrument für das qualitative Vorscreening antiviraler Medikamente sein.

HeLa-Zellen (eine humane Epithelzelllinie für Gebärmutterhalskrebs), HCT116-Zellen (eine humane kolorektale Karzinomzelllinie), U2OS-Zellen (eine humane Osteosarkomzelllinie) und RAW264.7-Zellen (eine Maus-Makrophagen-ähnliche Zelllinie) wurden in Dulbecco gehalten modifiziertes Eagle-Medium (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin. HMV-II-Zellen (eine humane maligne Melanomzelllinie) wurden in RPMI 1640-Medium (Wako), ergänzt mit 10 % FCS, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, gehalten. BHK-21-Zellen (eine Babyhamster-Nieren-Fibroblasten-Zelllinie) wurden in Eagle's minimalem essentiellen Medium (MEM, Nissui), ergänzt mit 5 % neugeborenem Kälberserum und 0,03 % L-Glutamin, gehalten. Caco-2-Zellen (eine menschliche Kolonkarzinomzelllinie) wurden in MEM, ergänzt mit 20 % FCS, 0,03 % L-Glutamin und 1 × MEM nicht-essentieller Aminosäuren (Gibco), gehalten. CHO-K1-Zellen (eine Eierstockzelllinie des chinesischen Hamsters) wurden in Ham's F12-Medium (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % FCS, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, gehalten. Alle Zelllinien wurden in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten.

Der offene Leserahmen von UnaG (GenBank-Zugangsnummer AB763906) wurde als DNA-Fragment (417 bp) von Integrated DNA Technologies (IDT) synthetisiert und das PCR-amplifizierte UnaG-Fragment wurde in das pBluescriptII SK(+) (Agilent) dazwischen eingefügt XhoI- und HindIII-Stellen, die pUnaG/pBSKII(+) erzeugen.

Um Plasmide für rekombinante SAFV-3-exprimierende Reporterproteine zu konstruieren, wurden die UnaG- und EGFP-Gene mit partiellen 2A- und 2B-Sequenzen durch PCR unter Verwendung von pUnaG/pBSKII (+) bzw. pEGFP-N1 (Clontech) als Matrizen amplifiziert. Die resultierenden PCR-Fragmente bestanden aus drei Teilen: dem Reportergen ohne das Startcodon, einer partiellen 2B-Sequenz, die für PVQS am 5'-Ende kodiert, und einer partiellen 2A-Sequenz, die für DIETNPG kodiert, am 3'-Ende. Außerdem wurden zwei Fragmente der SAFV-3-Sequenz (JPN08-404), Nt 3804 bis 4206 und Nt 4171 bis 4972 (Nummerierung gemäß der GenBank-Zugangsnummer HQ902242), durch PCR unter Verwendung des SAFV-3-infektiösen cDNA-Klons pSAF404 voller Länge amplifiziert [8] als Vorlage. Die drei separaten Fragmente wurden durch Overlap-Extension-PCR kombiniert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit NcoI und ClaI verdaut und in das mit denselben Restriktionsenzymen verdaute pSAF404 eingefügt. Diese rekombinanten Plasmide wurden sequenziert und als pSAF/UnaG und pSAF/GFP bezeichnet.

pSAF/UnaG und pSAF/GFP wurden mit NotI linearisiert und infektiöse RNA-Transkripte wurden mit einem CUGA 7 In-vitro-Transkriptionskit (NIPPON GENE) synthetisiert, um eine Beendigung der RNA-Transkription am Signal des menschlichen Präproparathormons (PTH) im Genom von SAFV zu vermeiden -3 (JPN08-404), wie zuvor beschrieben [8]. Um rekombinante Viren zu erzeugen, wurden BHK-21-Zellen in einer Dichte von 3,0 × 105 Zellen pro 35-mm-Schale ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Transkripte (10 µg) mit Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Zellen transfiziert. 20 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen und Überstände gesammelt und die Viren durch drei Einfrier- und Auftauzyklen präpariert, um Virionen freizusetzen, gefolgt von einer Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen. Diese geklärten Überstandsbestände von BHK-21-Zellen wurden als Passage 0 (P0) bezeichnet. Anschließend wurde das Virus in HeLa-Zellen vermehrt und das Lysat durch drei Einfrier- und Auftauzyklen hergestellt. Die Virustiter wurden durch einen Standard-Plaque-Assay an HeLa-Zellen bestimmt.

Die Expression des Reportergens in infizierten Zellen wurde mit einem JULI™ Smart Fluoreszenzzellanalysator (Digital Bio) oder einem EVOS M5000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific) erfasst, bei Bedarf mit Kernfärbung mit Hoechst 33342. Die Fluoreszenzintensität wurde mit der EVOS M5000-Software gemessen und analysiert.

Das SAF/UnaG-Virus oder das SAF/GFP-Virus wurde fünfmal seriell in HeLa-Zellen passagiert. Die Zellen und Überstände wurden von infizierten Zellen gesammelt und dann dreimal in ihrem Medium eingefroren und aufgetaut, gefolgt von einer Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen. Das Virus im geklärten Überstand wurde durch aufeinanderfolgende Infektion von HeLa-Zellen fünfmal seriell passagiert. Virale RNAs wurden aus dem geklärten Überstand der ersten, dritten und fünften Passage (P1, P3, P5) von SAF/UnaG und P3 von SAF/GFP mit einem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert. Die Erststrang-cDNAs wurden unter Verwendung der Reversen Transkriptase ReverTra Ace (TOYOBO) und des Primers für SAFV-3 (5′-CTTTCATCTACAGAATTCCAACG-3′) synthetisiert. Die erhaltenen cDNAs wurden einer PCR als Matrize unter Verwendung von KOD-plus-Neo-DNA-Polymerase (TOYOBO) und Primern für SAFV-3 unterzogen, die an die Außenseite des Reportergens anlagern. Die folgenden Primerpaare wurden verwendet: GFP vorwärts: 5′-TCAATCTACAGAGTTGATTTGTTC-3′ und rückwärts: 5′-CTCTGGTGAATTCAGTACAGTC-3′, UnaG vorwärts: 5′-GCCTCTTATTACAAACAAAGACTCCAAC-3′ und rückwärts: 5′-ATTTAGTTAGCACCCCACCTTGCAACTG-3′. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden auf 1 % Agarosegelen analysiert.

Die Wachstumskinetik für SAF/UnaG und rekombinante Wildtyp-SAFV-3-Viren (SAF404) wurde in HeLa-Zellen untersucht. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Well in einer 6-Well-Platte ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, gefolgt von der Inokulation jedes Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5. Nach der Virusadsorption bei 37 °C für Nach ca. 60 Minuten wurden sie zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) von Dulbecco gewaschen und bei 37 °C in DMEM mit 1 % FCS inkubiert. Die Zellen und Überstände jeder Kultur wurden 0, 3, 6, 10, 24 und 48 Stunden nach der Infektion gesammelt. Die zellassoziierten Viren wurden durch drei Einfrier- und Auftauzyklen aus den Zellen hergestellt. Zellfreie und zellassoziierte Viren wurden durch einen Standard-Plaque-Assay auf HeLa-Zellen titriert.

Zur Immunfluoreszenzfärbung von SAF404-infizierten Zellen wurden die Zellen auf Glasdeckgläsern gezüchtet und bei 37 °C mit SAF404 infiziert. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd 20 Minuten lang bei 4 °C fixiert, mit 0,2 % Triton X-100 15 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert und mit 5 % Magermilch in PBS-T 60 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Anti-SAFV-3-Antiserum [20] inkubiert, mit PBS-T gewaschen und dann mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Thermo Fisher Scientific) 60 Minuten lang bei Raum inkubiert Temperatur. Deckgläser wurden mit ProLong Diamond Antifade Mountant mit DAPI (Thermo Fisher Scientific) montiert. Die Bilder wurden mit einem Olympus IX73-Fluoreszenzmikroskop (Olympus) aufgenommen und die Anzahl der infizierten Zellen wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Pleconaril wurde von FUJIFILM Wako Pure Chemical bezogen. Pleconaril wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. HeLa-Zellen wurden mit einer Dichte von 4,4 × 104 Zellen/Well in eine 48-Well-Platte ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Verschiedene Konzentrationen von Pleconaril (0, 0,1, 1, 10, 20, 30, 40 und 50 µg/ml) wurden mit SAF/UnaG-Virus (2,75 × 105 PFU/550 µl) gemischt. Pleconaril/Virus-Mischungen wurden so hergestellt, dass die endgültige DMSO-Konzentration in jeder Vertiefung 0,5 % betrug, und dann vor der Infektion 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. HeLa-Zellen wurden mit vorbehandeltem SAF/UnaG-Virus bei einer MOI von 1 (1,25 × 105 PFU/Well) infiziert. Nach dreistündiger Virusadsorption bei 37 °C wurden sie zweimal mit PBS gewaschen und bei 37 °C in DMEM mit 10 % FCS inkubiert. Nach 16 Stunden wurden UnaG-exprimierende Zellen mit einem JULI™ Smart Fluoreszenzzellanalysator fotografiert. Die antivirale Aktivität von Pleconaril wurde anhand der Anzahl der Zellen mit UnaG-Fluoreszenz bewertet.

Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism-Software Version 7 (GraphPad Software) durchgeführt.

Unzutreffend.

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Wir danken Frau Saito für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI (Grant Number JP17K08865, JP21K07045) von der Japan Society for the Promotion of Science, Grant for Promoted Research von der Kanazawa Medical University (S2015-4, S2017-2, S2021-3), Grant for Assistance KAKEN von der Kanazawa Medical University (K2019-7, K2020-3, K2020-4).

TO und TH haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Mikrobiologie, Kanazawa Medical University School of Medicine, 1-1 Daigaku, Uchinada, Ishikawa, 920-0293, Japan

Takako Okuwa, Toshiki Himeda, Koichi Utani und Masaya Higuchi

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TO und TH konzipierten und führten die Experimente durch und verfassten das Manuskript. KU unterstützte die Plasmidkonstruktion und Zellkulturen. MH überwachte die Studie und redigierte die endgültige Fassung dieses Manuskripts. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Masaya Higuchi.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Okuwa, T., Himeda, T., Utani, K. et al. Erzeugung eines rekombinanten Saffold-Virus, das UnaG als Marker zur Visualisierung einer Virusinfektion exprimiert. Virol J 20, 175 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02142-8

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Eingegangen: 14. Februar 2023

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02142-8

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