Entwicklung von Peptidnukleinsäuren

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12482 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zahlreiche neuartige Methoden zum Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger wurden umfassend entwickelt, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten. Unter den wichtigen lebensmittelbedingten Bakterien wurde Bacillus cereus als besorgniserregender Krankheitserreger identifiziert, der verschiedene Lebensmittelkrankheiten verursacht, was zu einem Interesse an der Entwicklung wirksamer Nachweismethoden für diesen Krankheitserreger führte. Obwohl eine Standardmethode basierend auf Kultivierung und biochemischen Bestätigungstests verfügbar ist, ist sie zeit- und arbeitsintensiv. Es wurden alternative PCR-basierte Methoden entwickelt, denen es jedoch an Hochdurchsatzkapazität und Benutzerfreundlichkeit mangelt. In dieser Studie wird daher versucht, eine robuste Methode zum Nachweis von B. cereus zu entwickeln, indem die hochspezifischen Pyrrolidinylpeptid-Nukleinsäuren (PNAs) als Sonden für eine Bead-Array-Methode mit Multiplex- und Hochdurchsatzkapazität genutzt werden. In dieser Studie wurden PNAs mit Prolyl-2-aminocyclopentancarbonsäure (ACPC)-Rückgrat mit groEL-, motB- und 16S-rRNA-Sequenzen kovalent mit drei Sätzen fluoreszierend barcodierter Perlen gekoppelt, um die drei B. cereus-Gene zu erkennen. Das entwickelte acpcPNA-basierte Bead-Array zeigte eine gute Selektivität, wobei nur in Gegenwart von B. cereus Signale nachweisbar waren, nicht jedoch für andere Arten. Die Empfindlichkeit dieses acpcPNA-basierten Bead-Assays beim Nachweis genomischer DNA betrug 0,038, 0,183 bzw. 0,179 ng für groEL-, motB- und 16S-rRNA. Diese Leistung war dem DNA-Gegenstück deutlich überlegen und bestätigte somit eine viel stärkere Bindungsstärke von acpcPNA gegenüber DNA. Die Robustheit der entwickelten Methode wurde weiter durch Tests von künstlich angereicherter Milch und eingelegtem Senfgrün mit minimaler Beeinträchtigung durch Lebensmittelmetriken demonstriert. Daher hat sich diese Proof-of-Concept-Methode mit acpcPNA-basierten Bead-Arrays als wirksame alternative Nukleinsäure-basierte Methode für lebensmittelbedingte Krankheitserreger erwiesen.

Bacillus cereus ist einer der wichtigsten durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserreger, der in einer Vielzahl von Lebensmitteln vorkommt, von verzehrfertigen Lebensmitteln über fermentierte Lebensmittel bis hin zu Milchprodukten1. Aufgrund seiner Toleranz gegenüber extremen pH-Werten und Temperaturen wurde B. cereus häufig in verschiedenen Phasen der Lebensmittelverarbeitung gefunden2, was weltweit zu schwerwiegenden lebensmittelbedingten Ausbrüchen mit einer Gesamtprävalenz von bis zu 23,746 % führte. In Europa ist es nach Staphylococcus aureus3 die zweite Ursache für den lebensmittelbedingten Ausbruch. In den USA erkranken etwa 63.000 Menschen pro Jahr, mit einer Krankenhauseinweisungsrate von 0,4 % aufgrund der Bacillus-Gruppe4.

Schnelle und genaue Methoden, die eine rechtzeitige Überwachung und Erkennung von B. cereus in Lebensmitteln ermöglichen, können als wichtige Eindämmungsmethode bei der Reduzierung seiner Ausbrüche dienen. Da nicht alle Bacillus-Arten pathogen sind, ist es darüber hinaus unerlässlich, Bacillus-Arten bis auf die Ebene identifizieren zu können5. Während eine Standardmethode nach ISO 7932:2004 verfügbar ist, die auf einem Agarplatten-basierten Zählprotokoll6 basiert, ist diese Methode zeit- und arbeitsaufwändig (erfordert eine Inkubationszeit von bis zu 24 Stunden bei 30 °C mit zusätzlichen 2–7 Tagen zur Bestätigung). Assay) und erfordert geschultes Fachpersonal. Zur Identifizierung von B. cereus wurden alternative molekulare Methoden wie auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierende Techniken entwickelt7,8. Die meisten dieser PCR-basierten Methoden basieren jedoch auf Gelelektrophoresemethoden mit niedriger Auflösung, um PCR-Produkte sichtbar zu machen, was die Interpretation der Ergebnisse erschwert. Viele fortschrittliche PCR-basierte Techniken wie quantitative PCR (qPCR) und Multiplex-PCR wurden daher entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden9,10,11, ihre Multiplexkapazität ist jedoch aufgrund von Komplikationen durch die Bildung von Primer-Dimeren immer noch begrenzt12. Darüber hinaus sind die meisten PCR-basierten Methoden auf DNA als spezifische Sonde angewiesen, die durch Umweltfaktoren wie Temperatur, pH-Wert und Enzyme abgebaut werden kann.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellt diese Studie eine Nachweismethode für B. cereus vor, die die Vorteile der Multiplexkapazität und der einfachen Ergebniserfassung durch die Bead-Array-Technik mit hochspezifischer Peptidnukleinsäure (PNA) als alternativer Sonde kombiniert. Die in dieser Studie verwendete Bead-Array-Plattform basiert auf einer empfindlichen und multiplexen xMAP-Technologie mit hohem Durchsatz für verschiedene Arten von Zielen13,14. Bei dieser Methode werden paramagnetische, fluoreszierend mit Barcodes versehene Kügelchen verwendet, die mit Carboxylgruppen zur kovalenten Bindung nukleophiler Liganden funktionalisiert sind. Jeder Perlensatz kann durch einen roten Laser identifiziert werden, und das Signal wird von einem fluoreszierenden Reporter (R-Phycoerythrin) durch einen grünen Laser gemessen13,15,16. Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Microarray-Techniken bietet die Bead-Array-Technologie mehrere Vorteile. Erstens ist der Durchsatz dieser Technik deutlich höher. Dies liegt daran, dass es als halbautomatisch gilt, während dies bei der DNA-Microarray-Technologie nicht der Fall ist. Zweitens weist die Bead-Array-Technologie aufgrund ihres automatischen Waschschritts normalerweise einen geringeren Hintergrund und eine höhere Konsistenz auf als die DNA-Microarray-Technologie17. Schließlich sind die Kosten für einen Detektor in der Bead-Array-Technologie viel günstiger als die des DNA-Microarrays, was ihn praktischer macht. Daher wurden verschiedene DNA-basierte Bead-Array-Systeme erfolgreich zum Nachweis einer Vielzahl von Lebensmittelkontaminationen wie Lebensmittelallergenen18, lebensmittelbedingten Krankheitserregern in Hühnerfleisch19 und vier lebensmittelbedingten Krankheitserregern, darunter Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus und Shigella, eingesetzt spp. in Milchprodukten20. Interessanterweise erforderte die beschriebene Methode zum Nachweis von B. cereus eine erhöhte Temperatur von 38 °C, um ein nachweisbares Signal zu erhalten, was wahrscheinlich auf die geringere Stabilität der DNA-DNA-Bindung im Vergleich zur PNA-DNA-Bindung zurückzuführen ist. Dies macht es für die tatsächliche industrielle Verarbeitung unpraktisch20. Darüber hinaus verwendeten alle dieser beschriebenen Bead-Array-Methoden DNA als spezifische Sonde, deren Spezifität erheblich von der Hybridisierungstemperatur und der Länge der Sonden abhängt21. Wir vermuteten, dass die Verwendung alternativer Nukleinsäure-Mimetika mit besserer Bindungsaffinität zum DNA-Ziel die Gesamtleistung der Wahrnehmung verbessern könnte.

In diesem Zusammenhang wurde PNA, ein Nukleinsäure-Mimetikum, bei dem das Phosphodiester-Rückgrat durch ein Pseudopeptid-Rückgrat ersetzt wurde, aufgrund seiner verschiedenen Vorteile wie hoher thermischer Stabilität, hoher Sequenzspezifität und hoher Empfindlichkeit für die Unterscheidung von Fehlpaarungen ausgewählt22,23,24. In Kombination mit der hervorragenden Stabilität von PNA gegenüber Nukleasen und Proteasen wurde PNA für viele Anwendungen entwickelt, einschließlich der Nukleinsäuredetektion25,26,27. Die neueren Arten von PNAs, wie z. B. konformativ eingeschränkte PNAs28, wurden erfolgreich entwickelt und weisen eine noch bessere Leistung auf als die ursprüngliche PNA (derzeit bekannt als aegPNA). Vilaivan und Mitarbeiter entwickelten beispielsweise Pyrrolidinyl-PNA, das aus Nukleobasen-modifiziertem Prolin und fünfgliedrigen zyklischen β-Aminosäuren besteht (acpcPNA genannt)29,30. Dieses molekulare Merkmal verhindert den Abbau unter basischen Bedingungen durch intermolekulare Zyklisierung – eine Tatsache, die bei aegPNA, das aus α-Aminosäuren besteht, leicht geschieht31. Darüber hinaus hat acpcPNA eine starrere Struktur als aegPNA, was zu wünschenswerten Eigenschaften wie einer besseren antiparallelen Selektivität, einer höheren Bindungsaffinität und einer besseren Unterscheidungskraft gegenüber Einzelbasenfehlpaarungen führt32. Daher wurde acpcPNA als Sonde in DNA-Sensorstudien mit verschiedenen Plattformen33,34,35,36,37 wie papierbasierten Sensoren, Oberflächenplasmonresonanztechniken und elektrochemischen Techniken eingesetzt.

Nach unserem besten Wissen wurde die Luminex-Bead-Array-Plattform noch nie zuvor mit acpcPNA zum Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern kombiniert. Es gab nur eine Studie, die ein ähnliches Konzept der Kombination dieser Luminex-Bead-Array-Plattform und aegPNA zur Verbesserung der Nachweiskapazität für den Nachweis des HER2-Onkogens verwendete38. Es wurde gezeigt, dass unsere entwickelte Methode eine gute Sensorleistung mit der erforderlichen Robustheit aufweist, um B. cereus in Milch und eingelegtem Salat als Modelle für echte Lebensmittelproben zu erkennen. Daher ist die entwickelte Methode vielversprechend, um als praktische Plattform für den Nachweis von B. cereus übernommen zu werden, und das Konzept kann in Zukunft auch auf andere Krankheitserreger angewendet werden.

Die Sequenzen der in dieser Studie verwendeten acpcPNA-Sonden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die PNA-Sonden wurden mit Acetyl-verkapptem N-Terminus und modifiziertem C-Terminus mit einer Lysineinheit zur Konjugation mit den Carboxylgruppen auf den paramagnetischen Perlen39 synthetisiert.

Primersequenzen wurden mithilfe der Primer3-Software (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) basierend auf der GenBank-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) entworfen siehe Tabelle 1.

Die Bakterien wurden vom Thailand Bioresource Research Center, Thailand (TBRC), der American Type Culture Collection, Vereinigte Staaten von Amerika (ATCC) und dem Department of Medical Sciences, Thailand (DMST) bezogen (Tabelle 2). Mit Ausnahme von Bacillus spp. wurden alle auf einer 2xYT-Agarplatte (16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L Natriumchlorid und 15 g/L Agar) ausgestrichen und 16 Jahre lang bei 37 °C inkubiert –18 Uhr. Eine einzelne Bakterienkolonie wurde in 10 ml 2xYT-Brühe (16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt und 5 g/L Natriumchlorid) inokuliert und 16–18 Stunden lang bei 37 °C und 250 U/min inkubiert. Bacillus spp. wurden auf LB-Agarplatten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L Natriumchlorid und 15 g/L Agar) ausgestrichen und 16–18 Stunden bei 30 °C inkubiert. Eine einzelne Kolonie von Bacillus spp. wurde in 10 ml LB-Brühe (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L Natriumchlorid) inokuliert und bei 30 °C und 250 U/min 16–18 Stunden lang kultiviert.

Die genomische DNA jeder Bakterienprobe wurde mit einem QIAamp®DNA Minikit (#51304, Qiagen) gemäß der Bedienungsanleitung extrahiert. Kurz gesagt, Bakterienzellen wurden aus einer 1-ml-Probe durch 5-minütige Zentrifugation bei 7500 U/min gesammelt. Die Pellets wurden in 180 µL einer Enzymlösung (20 mg/ml Lysozym in 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA und 1,2 % Triton-X 100) suspendiert und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Pellets wurden 2 Stunden lang bei 56 °C mit 20 µL Proteinase K behandelt, bevor sie 2 Minuten lang mit 4 µL RNase A (100 mg/ml) bei Raumtemperatur behandelt wurden. Die genomische DNA wurde mit einer Qiagen-Mini-Spin-Säule unter Elution mit 50 µl sterilem Wasser weiter gereinigt. Konzentration und Reinheit der erhaltenen genomischen DNA wurden durch UV-Spektrophotometrie (NanoDrop 8000-Spektrophotometer, USA) bei 260 und 280 nm bestimmt.

Genomische DNA (50 ng) wurde als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die Zielamplikons mithilfe biotinylierter Primer zu amplifizieren. Eine PCR-Mastermix-Lösung enthielt 1,25 U Taq-DNA-Polymerase (#M0273S, Biolabs), 50 mM KCl, eine Mischung aus drei Biotin-markierten Primersätzen und 0,4 µM dNTP (#N022, SibEnzyme). Es wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei (1) 30 s lange Denaturierung bei 95 °C, (2) 30 s langes Primer-Annealing bei 52 °C und (3) 1 min lange DNA-Verlängerung bei 72 °C zum Einsatz kamen. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 1,5 % w/v Agarose (#2125, OmniPur) in 0,5 × TBE-Puffer (44,5 mM Tris, 44,5 mM Borsäure und 1 mM EDTA) und SYBR®Safe analysiert. Die Bilder der Agarosegele wurden unter UV-Licht (302 nm) aufgenommen, mit Größenidentifizierung durch einen DNA-Leitermarker (100 Basenpaare, M25, SibEnzyme).

Drei Sätze fluoreszierend mit Barcodes versehener Perlen (#MC10012, #MC10015, #MC10021, Luminex) wurden mit drei acpcPNAs gekoppelt, die für groEL-, motB- und 16S-rRNA-Gene spezifisch sind. Jede Perlenregion (5 × 106 Perlen/Region) wurde in 20 µL 0,1 M MES, pH 4,5 (#M5057, Sigma) resuspendiert und mit einer spezifischen acpcPNA (0,1 nmol) und 2,5 µL 10 mg/ml 1-Ethyl verknüpft -3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC·HCl, Thermo Fisher Scientific) für 30 Minuten (im Dunkeln). Nach diesem Zeitraum wurde die zweite Charge EDC·HCl (2,5 µL mit 10 mg/ml) zur Reaktion gegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Die mit PNA beladenen Perlen wurden mit 0,02 % Tween-20 (BioBasic Inc.) und 0,1 % SDS-Lösung (BioBasic Inc.) gewaschen, bevor sie in 20 µL TE-Puffer pH 8,0 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) rekonstituiert wurden. und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt.

Drei acpcPNA-Bead-Regionen (2.500 Beads/Region/Reaktion, jeweils 33 µL) wurden in 1,5 × TMAC (4,5 M TMAC, 0,15 % Sarkosyl-Lösung, 75 mM Tris-HCl und 6 mM EDTA, pH 8,0) gemischt und übertragen auf eine 96-Well-Platte ohne Bindung (#655901, Greiner Bio-One). Das biotinylierte PCR-Produkt (10 µL) wurde zu TE-Puffer (7 µL) gegeben, 10 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und 3 Minuten lang schnell auf Eis gelegt, um die DNA in einzelsträngiger Form zu halten. Für den Hybridisierungsschritt wurde die Lösung des denaturierten PCR-Produkts zu der Perlenmischung in der Platte mit 96 nicht bindenden Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei 25 °C unter Schütteln inkubiert, bevor alle ungebundenen PCR-Produkte durch dreimaliges Waschen mit 100 µL 1 entfernt wurden × TMAC-Puffer (3 M TMAC, 0,1 % Sarkosyl-Lösung, 50 mM Tris-HCl und 4 mM EDTA, pH 8,0) mit Hilfe einer magnetischen Trennplatte. R-Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (25 µl von 10 µg/ml SAPE, #S866, Life Technology™, USA) in 1 × TMAC-Puffer wurde zur Platte gegeben und in einem Mikrotiterplatten-Schüttler-Inkubator (Hercuvan Lab Systems, USA) inkubiert. ) bei 25 °C für 15 Min. Die Platte wurde dreimal mit 100 µL 1 × TMAC-Puffer gewaschen, um ungebundenes Streptavidin zu entfernen, bevor sie in 75 µL MAGPIX Drive Fluid (#40-50030, Luminex) resuspendiert wurde. Ein grüner Laser in einem Luminex-Instrument (MAGPIX™, Luminex, USA) wurde verwendet, um das Signal von Reportermolekülen bei 525 nm zu messen. Zur Identifizierung spezifischer Perlen wurde ein roter Laser bei 635 nm verwendet. Fluoreszenzsignale von SAPE wurden gemessen und als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben, was als positives Ergebnis gewertet wurde, wenn sein Wert mindestens zweifach höher war als der Hintergrund oder die Negativkontrolle (destilliertes Wasser als Vorlage bei der PCR-Amplifikation). .

Um die Spezifität der entwickelten Methode zu bewerten, wurde genomische DNA (50 ng) von sechs Nichtziel-Lebensmittelpathogenen (B. subtilis, E. coli, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium) verwendet Templates in den PCR-Reaktionen. Die PCR-Produkte wurden mit demselben PNA-Bead-Array unter Verwendung desselben Protokolls wie oben für B. cereus analysiert (fünf Wiederholungen).

Zur Sensitivität wurden unterschiedliche Konzentrationen genomischer DNA (0,002–200 ng) von B. cereus als Matrizen in PCR-Reaktionen verwendet und mit dem Bead-Array analysiert (zehn Replikate).

Die Nachweisgrenze (LOD) wurde als Konzentration der genomischen DNA mit einem Signal berechnet, das mehr als das Zweifache des Hintergrunds oder der Negativkontrolle (destilliertes Wasser als Matrize bei der PCR-Amplifikation) beträgt. Das Signal der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) wurde an die folgende Dosis-Wirkungs-Kurvengleichung angepasst.

Y ist eine Fluoreszenzintensität von RPE beim Nachweis genomischer DNA der Pathogenkonzentration X. wohingegen A, B und C Konstanten aus der Kurvenanpassung sind.

Drei spezifische DNA-Sonden (0,1 nmol) mit einem Hexyl-Spacer mit äquivalenten Sequenzen zu denen von acpcPNA wurden mit drei Bead-Regionen (#MC10026, #MC10061, #MC10027, Luminex) über Carbodiimid-Kopplung gekoppelt, wie im Abschnitt über Bead-Konjugation mit acpcPNAs beschrieben . Anschließend wurden die DNA-gekoppelten Perlen auf ihre Empfindlichkeit beim Nachweis verschiedener Konzentrationen genomischer DNA getestet, wie im Abschnitt zur Empfindlichkeit beschrieben.

Zur Validierung der entwickelten Methode wurden künstlich versetzte Lebensmittelproben getestet. Zwei Arten von Lebensmittelproben (Milch und eingelegtes Senfgrün) wurden in örtlichen Supermärkten gesammelt (12 Proben pro Probenart). Die Proben wurden vor dem Dotierungsexperiment mit der Methode der International Organization for Standardization 7932 (ISO 7932) auf Abwesenheit von B. cereus getestet. Jede B. cereus-freie Lebensmittelprobe (25 g) wurde mit 225 ml LB-Brühe in sterilen Mischbeuteln (#AES400/50G) 2 Minuten lang homogenisiert und anschließend mit B. cereus (10 KBE/ml in LB-Brühe) versetzt Inkubation bei 30 °C für 16–18 Stunden unter Schütteln bei 250 U/min. Genomische DNA wurde aus den angereicherten Lebensmittelproben mit einem QIAamp®DNA Minikit extrahiert, wie im Abschnitt zur Extraktion genomischer DNA beschrieben. Die extrahierte DNA (2 µL) wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation verwendet und mit dem Bead-Array wie oben beschrieben analysiert (drei Replikate).

Um B. cereus von anderen Arten in den Bacillus-Gruppen (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides und B. weihenstephanensis) zu unterscheiden, wurden zuvor Chaperon-groEL- und Mobility-motB-Gene ausgewählt robuste Biomarker durch bioinformatische Methoden aufgrund ihrer einzigartigen Sequenzen in B. cereus unter anderen Mitgliedern der Gattung37. Für die interne Kontrolle wird das essentielle 16S-rRNA-Gen aufgrund seiner in den Bakterien hochkonservierten Sequenz ausgewählt40. Tatsächlich ist es uns zuvor gelungen, acpcPNA dieser Gene als spezifische Sonde und interne Kontrolle bei der Entwicklung eines hochspezifischen und empfindlichen papierbasierten Sensors zum Nachweis von B. cereus zu verwenden37. Wichtig ist, dass die papierbasierte Plattform zwar theoretisch für Multiplexanalysen geeignet ist, die Entwicklung eines papierbasierten Sensorgeräts mit mehr als drei Genzielen jedoch im Allgemeinen sehr schwierig ist. Andererseits können dank der Halbautomatik der Bead-Array-Technologie insgesamt 50 Genziele in einer einzigen Testvertiefung enthalten sein. Ziel dieser Studie ist daher die Entwicklung einer Proof-of-Concept-Bead-Array-Technologie auf ACpcPNA-Basis, um die Multiplex- und Hochdurchsatzkapazität der Bead-Array-Plattform für den Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger mit überlegener Spezifität zu ermöglichen. Drei fluoreszierend mit Barcodes versehene Bead-Regionen wurden über die Kopplung zwischen der Carboxylgruppe auf dem Bead und der Aminogruppe am N-Terminus des PNA41 mit acpcPNA-Sonden verknüpft, deren Sequenzen mit groEL, motB und 16S-rRNA übereinstimmen (Abb. 1A). Die mit Kügelchen immobilisierten acpcPNA-Sonden wurden anschließend über eine starke Watson & Crick-Basenpaarung mit den biotinylierten Amplikons hybridisiert, die aus der Multiplex-PCR erhalten wurden (Abb. 1B, C). Anschließend wurde die mit Perlen eingefangene biotinylierte DNA mit einem R-Phycoerythrin-markierten Streptavidin markiert und die Fluoreszenzintensitäten mit Doppellasern gemessen (Abb. 1D, E).

Schematische Darstellung der acpcPNA-basierten Bead-Array-Methode. (A) Eine Carboxylgruppe auf jeder fluoreszierend mit einem Barcode versehenen paramagnetischen Perle ermöglicht die kovalente Konjugation mit der Aminogruppe auf dem acpcPNA-Molekül. (B) Drei Bead-Sets gekoppelt mit drei spezifischen acpcPNAs an groEL-, motB- und 16S-rRNA-Gene wurden verwendet, um biotinylierte PCR-Produkte aus einer Multiplex-PCR-Methode zu erkennen. (C) Biotinylierte einzelsträngige DNA wurde nach Denaturierung bei 95 °C mit acpcPNA-basierten Perlen hybridisiert. (D) R-Phycoerythrin-markierte Streptavidin (SAPE)-Moleküle wurden an den Biotin-Tag am DNA-PNA-Perlenkomplex gebunden. (E) Ein grüner Laser wurde verwendet, um das Fluoreszenzsignal von SAPE zu erkennen, und ein roter Laser wurde verwendet, um den Bereich des Perlensatzes zu identifizieren.

Um die Bindungseffizienz synthetisierter acpcPNA-Sequenzen an ihre entsprechenden komplementären DNAs zu bewerten, wurde jeder Typ von acpcPNA-Kügelchen (groEL, motB und 16S rRNA) separat mit seinen komplementären DNA-Sequenzen hybridisiert (Abb. S1). Das Ergebnis zeigte, dass die acpcPNAs in allen Fällen spezifisch an ihre komplementären DNAs binden konnten. Dieses erfolgreiche Ergebnis kann auf die konformativ eingeschränkte Natur der PNA und das Fehlen negativer Ladungen am Rückgrat zurückgeführt werden – beides trug zur starken Bindungsaffinität bei32. Darüber hinaus zeigte die Kombination aller drei Perlen und ihrer komplementären DNA immer noch deutliche Fluoreszenzsignale, wenn auch mit leicht verringerten Intensitäten. Dieser Befund bestätigte, dass dieses Sensorsystem Potenzial für komplexere Studien hat.

Anschließend wurde eine Reihe von Optimierungen durchgeführt, um eine möglichst gute Leistung für Hybridisierungsexperimente mit Amplifikaten zu erzielen, die viel größer sind als die komplementären DNA-Stränge. Zu den zu optimierenden Schlüsselparametern gehörten die Hybridisierungszeit, die Konzentrationen des Reportermoleküls (R-Phycoerythrin-markiertes Streptavidin) und die Konzentrationen der Primer. Es wurden verschiedene Hybridisierungszeiten von 15 bis 60 Minuten getestet. Wie in Abb. S2 gezeigt, ergab die 30-minütige Hybridisierung das höchste Signal-Hintergrund-Verhältnis für das groEL-Gen, während die 60-minütige Hybridisierung für die motB- und 16S-rRNA-Gene am besten war. Daher wurde eine Hybridisierungszeit von 60 Minuten gewählt. Außerdem deutet Abb. S3 darauf hin, dass 10 µg/ml des Reportermoleküls die besten Ergebnisse lieferten, wobei die Signal-Hintergrund-Verhältnisse für groEL-, motB- und 16S-rRNA-Gene bei 8,41, 4,06 bzw. 2,44 lagen. Da die Multiplex-PCR zu Komplikationen führen kann, sind schließlich auch die Primerkonzentrationen ein Schlüsselfaktor, der optimiert werden muss. Dies geschah, indem man sich zunächst auf den Primer des Kontrollgens (16S-rRNA) konzentrierte, da dieser aufgrund seiner hohen Häufigkeit in der genomischen DNA-Matrize wahrscheinlich die Amplifikation dominiert. Vorläufige Experimente legten nahe, dass 50 nM die kleinste Konzentration des 16S-rRNA-Primers ist, die noch ein nennenswertes Signal liefern kann. Außerdem wurde in einem anderen separaten Experiment festgestellt, dass ein Mengenverhältnis von groEL:motB-Primern von 1:2 die größte Signalintensität für die gleichzeitige Amplifikation unter Verwendung dieser beiden Gene lieferte. Anschließend fügten wir diese vorläufigen Daten zur endgültigen Optimierung für die Multiplex-PCR zusammen, wie in Abb. S4 gezeigt, wobei sowohl die Konzentration des 16S-rRNA-Primers (bei 50 nM) als auch das Mengenverhältnis der groEL- und motB-Primer (1: 2) wurden konstant gehalten. Das heißt, nur die Konzentrationen der groEL- und motB-Primer wurden variiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit Ausnahme der niedrigsten getesteten Konzentrationen andere Bedingungen keine signifikant unterschiedlichen Ergebnisse lieferten. Daher schienen die zweitniedrigsten Primerkonzentrationen die logischste Wahl zu sein. Diese Bedingung (300:600:50 nM groEL-, motB- bzw. 16S-rRNA-Primer) konnte jedoch bei anderen getesteten Bakterienarten nicht zu nennenswerten Amplifikationen führen. Daher wurden stattdessen die Konzentrationen von 400:800:50 nM der groEL-, motB- und 16S-rRNA-Primer für nachfolgende Studien ausgewählt.

Die Spezifität der entwickelten Methode wurde anhand von sieben relevanten lebensmittelbedingten Arten bewertet, nämlich B. cereus, B. subtilis, Escherichia coli, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. In jedem Fall wurde die isolierte genomische DNA als Vorlage für die Multiplex-PCR-Amplifikation mit Biotin-Tagging an allen drei Zielgenen verwendet und mit dem acpcPNA-basierten Bead-Array getestet. Beim Nachweis von B. cereus zeigten sowohl groEL- als auch motB-Kügelchen positive Ergebnisse, wobei das höchste Signal des groEL-Kügelchens bei etwa dem 7-fachen Signal-Hintergrund-Verhältnis lag (Abb. 2). Die Signale von groEL- und motB-Kügelchen für andere getestete Bakterien waren negativ, während die interne Positivkontrolle der 16S-rRNA-Kügelchen bei allen Bakterienarten positiv war, was bestätigt, dass dieses Gen als robuste interne Kontrolle für diese Sensorplattform eingesetzt werden kann.

Spezifität des acpcPNA-basierten Bead-Array-Nachweises gegen B. cereus, B. subtilis, E. coli, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. Von jeder Art wurde eine genomische DNA-Probe (50 ng) getestet. Jede Datengruppe wurde als Durchschnitt von fünf Wiederholungen mit einem Fehlerbalken dargestellt, der eine Standardabweichung angab. Die gepunktete Linie stellt einen Grenzwert dar, der das Zweifache der Intensität der Negativkontrolle beträgt. Die Negativkontrolle enthielt Wasser als Matrize für die Amplifikation.

Insgesamt waren die beim Nachweis längerer DNA-Amplikons (200–310 bp) erhaltenen Signale zwar niedriger als die bei kurzen synthetischen DNA-Oligonukleotiden erhaltenen Signale (Abb. S1), die Ergebnisse reichen jedoch für eine eindeutige Identifizierung von B. cereus aus. Dieser Rückgang der Signalintensität ist nicht überraschend, da die hier verwendeten Amplikons 200–310 bp groß sind, was viel länger ist als Sondensequenzen auf dem festen Träger (12–15 bp). Angesichts der Möglichkeit, aus DNA in dieser Länge Sekundärstrukturen zu bilden16,42, werden die Ergebnisse als anständig angesehen. Darüber hinaus könnte das niedrigere Signal auf die Komplikation von Multiplex-PCR-Amplifikaten zurückzuführen sein. Die erhöhte Anzahl von Primersätzen für mehrere Ziele innerhalb einer einzigen Reaktion könnte aufgrund der Bildung von Primerdimeren zu falschen Amplifikationsprodukten führen43.

Die Nachweisgrenze (LOD) dieser Methode wurde für alle Gene bewertet, die zum Nachweis bekannter genomischer DNA-Konzentrationen verwendet wurden (Abb. 3A). Ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenzintensitäten wurde bei etwa 0,1 ng beobachtet, wobei das Signal linear bis etwa 1 ng anzusteigen begann, bevor es ein Plateau erreichte16. Mit dem groEL-PNA-Bead konnten bereits 0,038 ng genomische DNA nachgewiesen werden, während die motB- und 16S-rRNA-Beads LOD-Werte von 0,183 bzw. 0,179 ng genomischer DNA ergaben. Die erhaltenen LOD-Werte sind weniger empfindlich als bei unserem vorherigen papierbasierten Sensor37, was an der Verwendung von Multiplex-PCR liegen könnte, die bekanntermaßen komplizierter zu entwickeln und oft weniger empfindlich als herkömmliche PCR44 ist. Die Multiplexkapazität dieser entwickelten Methode und die Einfachheit einer einstufigen Multiplex-PCR stellen jedoch einen wichtigen Fortschritt der Nachweismethode dar, da sie darüber hinaus den Nachweis anderer wichtiger Gene wie Brechtoxin-Gene aus B. cereus-Stämmen42 und spezifischer Gene für umfassen kann andere Bakterien. Wichtig ist, dass die überlegene Leistung von acpcPNA gegenüber DNA auch durch die Bewertung der Erkennungsleistung von DNA-Sonden mit denselben Sequenzen wie die in dieser Studie verwendeten acpcPNA-Sonden nachgewiesen wurde (Abb. 3B). Während die LOD der groEL-DNA-Perle mit der des acpcPNA-Gegenstücks vergleichbar war (0,032 ng bzw. 0,038 ng), schien das Signal der groEL-DNA-Perle interessanterweise deutlich ein etwas höheres Plateau, d. h. ein höheres Signal-Hintergrund-Verhältnis, zu erreichen höhere Menge an genomischer DNA-Probe (~ 30 ng) als bei der acpcPNA-Perle. Dennoch konnten die motB- und 16S-rRNA-DNA-Kügelchen in keiner der getesteten Mengen genomischer DNA genomische DNA nachweisen (Abb. 3B). Dies könnte durch die geringe Stabilität der Duplexe erklärt werden, die zwischen den relativ kurzen DNA-Sonden und dem DNA-Ziel gebildet werden. Die Ergebnisse bestätigen die überlegene Leistung von acpcPNA gegenüber DNA-Sonden hinsichtlich der Robustheit im Multiplex-Assay.

Reaktionen von (A) acpcPNA-basierten Arrays (LOD = 0,038 ng (a), 0,183 ng (b) und 0,179 ng (c) genomischer DNA für groEL-, motB- und 16S-rRNA-PNA-Kügelchen) und (B ) DNA-basierte Bead-Arrays (LOD = 0,032 ng (a) für groEL-DNA-Bead). Jeder Datenpunkt wurde als Durchschnitt von zehn Wiederholungen mit einem Fehlerbalken aufgetragen, der eine Standardabweichung angab. Die gepunktete Linie am unteren Rand des Diagramms stellt einen Grenzwert dar, der doppelt so hoch ist wie die Intensität der Negativkontrolle.

B. cereus-Ausbrüche wurden in verschiedenen Lebensmitteln gemeldet, beispielsweise in stärkehaltigen Lebensmitteln und Reis, rohem und verarbeitetem Gemüse, Brot, Milch und Milchprodukten, Fleischprodukten und verzehrfertigen Lebensmitteln2,3. Um die entwickelte Methode zu validieren, wurden zwei Arten von Lebensmittelmatrizen, nämlich Milch und eingelegtes Senfgrün, ausgewählt, um Milchprodukte und verzehrfertige Lebensmittel darzustellen. Vor den Dotierungsexperimenten wurde mit der Methode ISO 7932 bestätigt, dass die Lebensmittelproben frei von B. cereus waren. Die B. cereus-freie Milch und das eingelegte Senfgrün (n = 12 pro Lebensmittelmatrix) wurden mit 10 KBE/g B. cereus versetzt. Diese Zahl liegt unter der maximal zulässigen Anzahl von B. cereus (102 KBE/ml und 50 KBE/g für Kinder unter 6 Monaten) gemäß der Codex-Alimentarius-Kommission der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO). ) und der Weltgesundheitsorganisation (WHO)45. Anschließend wurden die dotierten Proben durch Inkubation bei 30 °C über Nacht angereichert, gefolgt von einer genomischen DNA-Extraktion. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden durch Multiplex-PCR unter den zuvor erhaltenen optimalen Bedingungen hergestellt und die Mengen der DNA-Zielsequenz für die drei Gene wurden mit dem acpcPNA-basierten Bead-Array gemessen. Als Positivkontrolle wurde das Kulturmedium mit 10 KBE/g B. cereus verwendet. In dieser Studie gab es drei Arten von Negativkontrollen, um alle Möglichkeiten abzudecken, einschließlich der Verwendung von destilliertem Wasser als Matrize für die PCR-Amplifikation und der Verwendung von nicht dotierten Matrizen für die DNA-Reinigung vor der PCR-Amplifikation. Erfreulicherweise konnte der entwickelte Assay drei spezifische Gene von B. cereus mit geringer Beeinträchtigung der Lebensmittelmatrix identifizieren (Abb. 4). Die groEL-Perle lieferte erneut das höchste Signal in beiden Matrizen. Die geringeren Signale, die von eingelegtem Senfgrün erhalten werden, sind wahrscheinlich auf das Vorhandensein verschiedener Inhibitoren wie Enzyme, Polysaccharide, Proteine ​​und Salz zurückzuführen, die alle die genomische DNA-Extraktion und die anschließende PCR-Amplifikation beeinträchtigen könnten9. Dennoch zeigten die Daten realer Lebensmittelmatrizen deutlich, dass das entwickelte acpcPNA-basierte Bead-Array als alternative Methode für den spezifischen und Multiplex-Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger eingesetzt werden kann.

Das acpcPNA-basierte Bead-Array dient zum Nachweis von B. cereus in künstlich versetzten Lebensmittelproben. B. cereus (10 KBE/ml) wurde in Milch, eingelegtes Senfgrün und eine Positivkontrolle (Kulturmedium) gegeben. Jede Datengruppe wurde als Durchschnitt von 12 Proben mit einem Fehlerbalken dargestellt, der eine Standardabweichung angab. Die gestrichelte Linie stellt einen Cut-off-Wert dar, der das Zweifache der Intensität der Negativkontrolle (Wasser als Matrize bei der PCR-Amplifikation) beträgt.

In dieser Studie haben wir erfolgreich eine Multiplex-ACPCPNA-basierte Bead-Array-Technik entwickelt, um Bacillus cereus mit guter Spezifität, niedriger Nachweisgrenze und hoher Durchsatzkapazität zu identifizieren. Die Gesamttestzeit von 4 Stunden, einschließlich der Multiplex-PCR-Amplifikation, ist kürzer als bei der kulturbasierten ISO-Methode, die mindestens 72 Stunden zur Identifizierung von B. cereus benötigt. Die Validierung der entwickelten Methode mit repräsentativen realen Lebensmittelmatrizen zeigt, dass unsere Methode den vorherrschenden B. cereus-Erreger genau erkennen kann und ihre Praktikabilität zur Unterstützung der Lebensmittelsicherheit in industriellen Prozessen weiter untersucht werden kann.

Die während der aktuellen Studie analysierten Datensätze sind im GenBank-Repository verfügbar, [groEL Gene ID: 72447092; motB-Gen-ID: 72451176; 16S rRNA-Nukleotid-ID: NR_074540.1].

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Die Autoren danken dem National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC) und der Chulalongkorn University – NSTDA Doctoral Scholarship, The 90th Anniversary of Chulalongkorn University Scholarship und dem Overseas Research Experience Scholarship für Doktoranden für finanzielle Unterstützung. Diese Forschung erhielt auch finanzielle Unterstützung von der NRSF über die Program Management Unit for Human Resources & Institutional Development, Research and Innovation (Fördernummer PMU-B: B16F640114).

Nationales Zentrum für Gentechnik und Biotechnologie (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Khlong Luang, Pathum Thani, Thailand, 12120

Prae Noppakuadrittidej, Ratthaphol Charlermroj, Manlika Makornwattana, Sudtida Kaew-amdee und Nitsara Karoonuthaisiri

Department of Chemistry, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Thailand, 10330

Prae Noppakuadrittidej, Tirayut Vilaivan und Thanit Praneenararat

Programm für Biotechnologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Thailand, 10330

Vor Noppakuadrittidej

Abteilung für Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Thailand, 10330

Rungaroon Waditee-Sirisattha

Forschungseinheit für organische Synthese, Abteilung für Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Thailand, 10330

Tirayut Vilaivan

Internationales gemeinsames Forschungszentrum für Ernährungssicherheit, Khlong Luang, Pathum Thani, Thailand, 12121

Thanit Praneenararat und Nitsara Karoonuthaisiri

Institut für globale Ernährungssicherheit, Queen's University Belfast, Belfast, Großbritannien

Karoonuthaisiri richtete

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PN führte in dieser Studie alle Laborexperimente durch. RC half bei einigen Experimenten und gab Ratschläge zu verschiedenen Aspekten der Studie. MM leistete Unterstützung bei PCR-Experimenten und bioinformatischen Analysen. SK leistete Unterstützung bei Bead-Array-Experimenten. RW leistete Unterstützung bei der bioinformatischen Analyse. TV leistete Unterstützung in der PNA-Chemie. TP und NK verfassten das Manuskript und überwachten alle Forschungsaktivitäten.

Korrespondenz mit Thanit Praneenararat oder Nitsara Karoonuthaisiri.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Noppakuadrittidej, P., Charlermroj, R., Makornwattana, M. et al. Entwicklung einer auf Peptid-Nukleinsäuren basierenden Bead-Array-Technologie für den Nachweis von Bacillus cereus. Sci Rep 13, 12482 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38877-1

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Eingegangen: 26. April 2023

Angenommen: 17. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38877-1

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