Entwicklung und Wirksamkeitsbewertung von Händedesinfektionsmitteln und Polymilchsäurefilmen mit Kaffeesäure und Vanillin für verbesserte antivirale Eigenschaften gegen HCoV

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 194 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Auch drei Jahre nach dem Ausbruch von SARS-CoV-2 hat das Virus immer noch erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft. Die Infektion durch Atemtröpfchen ist der Hauptübertragungsweg, die Übertragung des Virus durch Oberflächenkontakt kann jedoch nicht ignoriert werden. Händedesinfektionsmittel und antivirale Filme können zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 eingesetzt werden, aber Desinfektionsmittel und Filme weisen Nachteile auf, wie z. B. die Resistenz des Virus gegen Ethanol und Umweltprobleme, einschließlich der übermäßigen Verwendung von Kunststoffen. Daher wurde in dieser Studie vorgeschlagen, natürliche Substrate auf Händedesinfektionsmittel und antivirale Filme aus biologisch abbaubarem Kunststoff (PLA) anzuwenden. Von diesem Ansatz werden Vorteile für die einfache Bekämpfung von SARS-CoV-2 durch den Einsatz natürlicher Substanzen erwartet.

Antivirale Desinfektionsmittel und Filme wurden durch Zugabe von Kaffeesäure und Vanillin zu Ethanol, Isopropylalkohol, Benzalkoniumchlorid und PLA hergestellt. Die antivirale Wirksamkeit wurde mit leicht modifizierten internationalen Standardtestmethoden EN 14.476 und ISO 21.702 bewertet.

In Suspension zeigten alle in dieser Studie bewerteten Händedesinfektionsmittel eine Reduzierung um mehr als 4 log innerhalb von 2 Minuten gegenüber HCoV-229E. Durch die Zugabe natürlicher Substanzen zu den Händedesinfektionsmitteln verkürzte sich die Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze des Virustiters sowohl in der Suspension als auch in der Schweinehaut. Bei Benzalkoniumchlorid wurde jedoch kein Unterschied in der Zeit beobachtet, die benötigt wurde, um die Nachweisgrenze des Virustiters zu erreichen. Bei antiviralen Filmen zeigten diejenigen, die sowohl aus PLA als auch aus natürlichen Substanzen hergestellt wurden, in allen Behandlungsgruppen eine Reduzierung von HCoV-229E um 1 Log im Vergleich zum reinen PLA-Film. Darüber hinaus wurde der Einfluss der organischen Belastung anhand der Anzahl der Kontakte der antiviralen Produkte mit Schweinehaut bewertet. Zehnmaliges Reiben auf der Haut führte zu einer etwas höheren antiviralen Aktivität als 50maliges Reiben.

Diese Studie ergab, dass Kaffeesäure und Vanillin wirksam zur Bekämpfung von HCoV-229E in Händedesinfektionsmitteln und antiviralen Filmen eingesetzt werden können. Darüber hinaus wird empfohlen, organische Stoffe von der Haut zu entfernen, um die antivirale Aktivität des Händedesinfektionsmittels und des antiviralen Films aufrechtzuerhalten, da die antivirale Aktivität in dieser Studie mit zunehmender organischer Belastung abnahm.

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) trat erstmals 2019 in Wuhan, China, auf und verbreitete sich in kurzer Zeit weltweit und verursachte im November 2022 etwa 645 Millionen Infektionen und 6,6 Millionen Todesfälle [1]. SARS-CoV-2 wird als neues Beta-Coronavirus in der Familie der Coronaviridae eingestuft. SARS-CoV-2 ist ein umhülltes Virus mit einzelsträngiger Positivsinn-RNA [2]. Dieses Virus verursacht nicht nur Atemwegsbeschwerden wie Husten, Halsschmerzen, Atembeschwerden und eine laufende Nase, sondern führt auch zu Magen-Darm-Beschwerden wie Durchfall, Erbrechen und Bauchschmerzen [3]. Nach Angaben der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) der Vereinigten Staaten ist der Hauptübertragungsweg für SARS-CoV-2 der Kontakt der Schleimhaut mit kontaminierten Oberflächen über die Hände oder die direkte Exposition der Atemwege gegenüber enthaltenden Tröpfchen das Virus durch persönlichen Kontakt [4]. Aus diesen Gründen betonen die Weltgesundheitsorganisation (WHO) und das CDC immer wieder die Bedeutung der Händehygiene [5] und fordern, dass gängige Kontaktflächen wie Edelstahl, Kunststoff und Glas verwendet werden, die eine hohe Stabilität für SARS-CoV aufweisen -2, werden in einem sauberen Zustand gehalten [6, 7]. Das CDC hat insbesondere Einkaufswagengriffe, Aufzugsknöpfe, Tastaturen und Wasserhähne als Beispiele für Oberflächen ausgewählt, mit denen Menschen routinemäßig in Kontakt kommen [8]. Daher wurden viele Studien durchgeführt, um eine sekundäre Ansteckung durch die Verwendung eines antiviralen Films als zusätzliche Methode zur Desinfektion dieser Oberflächen zu verhindern [9].

Antivirale Filme, die Kupfer und Silber enthalten, werden derzeit kommerzialisiert und sind weit verbreitet [10]. Die antiviralen Eigenschaften dieser Filme könnten durch den Zusatz von Inhaltsstoffen wie Teeextrakt und ätherischen Ölen verstärkt werden [11]. Zusätzliche Forschung wurde durchgeführt, um die Exposition von Menschen gegenüber Viruspartikeln zu minimieren und zu verhindern, dass sich diese Partikel auf der Oberfläche absetzen, indem physikalische Eigenschaften wie Superhydrophobie angewendet werden [10]. Daher wurde PLA ausgewählt, weil es mit anderen Materialien konjugiert werden kann und durch Hydrophobie die Adhäsion eines Virus auf einer Oberfläche hemmt [12]. Darüber hinaus kann PLA aufgrund seiner hervorragenden Eigenschaften wie Umweltfreundlichkeit, biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Hydrophobie in verschiedenen Bereichen wie Medizin, Verpackung, Elektronik, Automobil und Textilien eingesetzt werden [12].

Die Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln wird seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 evaluiert. Untersuchungen von Herdt und Mitarbeitern [13] deuten auf eine Verringerung um mehr als 4 log während einer 30-sekündigen Behandlung mit Ethanol und Händedesinfektionsmitteln auf Basis von quaternärem Ammonium hin. Darüber hinaus wurden Untersuchungen durchgeführt, um die antivirale Wirkung zu bewerten, indem der Anteil an Desinfektionsmitteln angepasst wurde [14] oder natürliche Substanzen mit antiviraler Wirkung zu den bestehenden Formulierungen hinzugefügt wurden, um die viruzide Wirkung zu erhöhen [15, 16]. Naturstoffe stellen seit der Antike hervorragende Behandlungsalternativen für verschiedene Infektionskrankheiten dar [17]. Insbesondere sekundäre Pflanzenstoffe wie Flavonoide, Alkaloide und Polyphenole, die hauptsächlich in Pflanzen vorkommen, bieten Vorteile für den Menschen [18]. Darüber hinaus zeigen sekundäre Pflanzenstoffe eine antimikrobielle Aktivität [19], insbesondere Alkaloide, Terpene, Flavonoide und Glykoside zeigen eine starke antivirale Aktivität gegen hochpathogene Influenza-, Dengue-, Polio- und Adenoviren [20].

Kaffeesäure ist ein Polyphenol, das in Kaffee, Beeren und Tee enthalten ist [21]. Kaffeesäure zeigt biologische Aktivitäten, einschließlich entzündungshemmender, krebsbekämpfender und immunstärkender Wirkungen [22, 23], und kann als antivirale Substanz eine Rolle spielen. Mehrere Studien haben berichtet, dass Kaffeesäure wirksam gegen das Virus ist, das ein schweres Fieber-Thrombozytopenie-Syndrom verursacht, da es die Bindung des Virus an eine Wirtszelle hemmt und die Replikation der viralen RNA von Herpes simplex und dem Influenza-A-Virus stört [24,25 ,26]. Man geht davon aus, dass die antiviralen Mechanismen von Kaffeesäure gegen SARS-CoV-2 darauf zurückzuführen sind, dass sie auf Strukturen des Virus, das Spike-Protein, das nichtstrukturierte Protein und die Hauptprotease abzielen [21]. Obwohl der antivirale Mechanismus nicht eindeutig identifiziert wurde, wurde in einer Studie [27] erwähnt, dass Kaffeesäure mit einer hohen Bindungsaffinität an die A5-Domäne des Hitzeschockproteins auf der Zelloberfläche gebunden ist, die als Mechanismus hinter SARS-CoV-2 fungiert Erkennung des Wirts und unterdrückt dadurch die Bindung zwischen Wirt und Virus. Darüber hinaus wurde in anderen Studien [28, 29] erwähnt, dass Kaffeesäure an die Hauptprotease und das nichtstrukturierte Protein gebunden werden kann, die für die Reife und Replikation des Virus unerlässlich sind, wodurch der proteolytische Prozess gehemmt und die enzymatische Aktivität durch Konkurrenz verringert wird Hemmung, was wiederum die Möglichkeit einer SARS-CoV-2-Übertragung verringert.

Vanillin ist ein phenolischer Aldehyd, der aus der Vanilleschote isoliert wird und hauptsächlich in Aromastoffen, Lebensmittelzusatzstoffen, Parfüms und pharmazeutischen Produkten verwendet wird [30]. Kürzlich wurden mehrere Studien zu den gesundheitlichen Vorteilen von Vanillin veröffentlicht, darunter krebsbekämpfende, antioxidative, entzündungshemmende [31,32,33] und antivirale Wirkungen [34]. Studien [35, 36] haben die Wirksamkeit von Vanillin gegen das Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2 sowie das H1N1-Virus nachgewiesen. Mit 500 ppm M. officinalis-Extrakt wurde eine Reduzierung der zytopathischen Wirkung um 60 % erreicht, während mit 125 ppm Vanillin eine Reduzierung der zytopathischen Wirkung um 85 % erreicht wurde. Ähnlich wie bei Kaffeesäure wurde der genaue Wirkmechanismus von Vanillin nicht identifiziert, Vanillin zielt jedoch auf die Hauptprotease und das Spike-Protein von SARS-CoV-2 ab [21]. Vanillin kann durch Van-der-Waals-Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Bindungen einen stabilen Bindungszustand an das Protein von SARS-CoV-2 aufrechterhalten, was die Infektiosität des Wirts durch die kompetitive Verbindung zwischen der Rezeptorbindungsdomäne von SARS-CoV-2 und reduzieren kann Angiotensin-Converting-Enzym 2 im Spike-Protein [34, 37]. Darüber hinaus könnte dies eine Möglichkeit sein, die Translation viraler Polyproteine ​​und die Replikaseaktivität in der Hauptprotease zu hemmen [38].

Händedesinfektionsmittel und antivirale Filme gelten als wirksame Strategien zur Eindämmung der Ausbreitung von SARS-CoV-2. Ihre antivirale Aktivität könnte jedoch in Umgebungen eingeschränkt sein, in denen organische Substanzen und Hüllviren vorkommen [39]. Darüber hinaus entwickeln Krankheitserreger durch die kontinuierliche Anwendung von Händedesinfektionsmitteln oder antiviralen Filmen Resistenzen gegen die Wirkstoffe, was ein ernstes Problem darstellt [40]. Eine kürzlich durchgeführte Studie, in der die Lebensfähigkeit der Omicron- und Wuhan-Stämme in Plastik und Haut verglichen wurde, zeigte, dass die Lebensfähigkeit von Omicron mehr als doppelt so hoch war wie die von Wuhan und dass in Desinfektionsexperimenten eine um 7 % höhere Ethanolkonzentration erforderlich war, um die gleiche Inaktivierung im Vergleich zu zu erreichen Wuhan-Stamm [41]. Daher ist die Entwicklung sicherer und wirksamer Händedesinfektionsmittel und antiviraler Filme erforderlich, die synergistische Effekte zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 erzeugen können.

Der Hauptzweck dieser Studie bestand darin, die antivirale Wirkung von Kaffeesäure und Vanillin als natürliche Substanzen gegen HCoV-229E, einen Ersatz für SARS-CoV-2, zu bewerten. Um ihre antiviralen Eigenschaften zu bewerten, wurden neuartige Händedesinfektionsmittel und PLA-Folien hergestellt, die Vanillin und Kaffeesäure enthielten. Die antiviralen Wirkungen der neu formulierten Händedesinfektionsmittel und antiviralen PLA-Folien wurden anhand eines Schweinehautmodells als Ersatz für menschliche Haut bewertet.

Menschliche Lungenfibroblasten-MRC-5-Zellen (Zellstamm 5 des Medical Research Council) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA) erworben. MRC-5-Zellen wurden unter Verwendung von Eagle's minimalem essentiellen Medium (MEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), gemischt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Gibco, Rockville, MD, USA) und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultiviert (Gibco). Die Zellen wurden in einer 75-cm2-Kulturflasche kultiviert und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Wenn die Zelldichte unter dem Mikroskop nahezu 100 % betrug, wurde mit der Subkultur begonnen. Zunächst wurde das Zellkulturmedium verworfen und zweimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS; Sigma-Aldrich) gewaschen. Dann wurde die PBS-Lösung abgesaugt und 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA(1X) (Gibco) vorsichtig zugegeben, um die Zellen vom Boden des Kolbens zu lösen. Nach 6 bis 10 Minuten Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde vorsichtig mit 1 ml frischem Zellkulturmedium gemischt und in einen neuen Kolben überführt. Alle diese Eingriffe wurden alle 2 bis 4 Tage durchgeführt.

Das menschliche Coronavirus 229E (HCoV-229E) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA) zur Verwendung als Ersatz für SARS-CoV-2 bezogen. Als die Zelldichte unter dem Mikroskop nahezu 90–100 % betrug, wurde das Zellkulturmedium verworfen und zweimal mit DPBS gewaschen. Nachdem DPBS abgesaugt wurde, wurde die genaue Menge der HCoV-229E-Suspension mit MOI (Multiplizität der Infektion) = 0,1 berechnet und das Virus vorsichtig in die Zellkulturflasche injiziert. Anschließend wurde der Kolben 2 Stunden lang in einen Inkubator mit 5 % CO2 bei 33 °C gestellt, um die Virusanhaftung sicherzustellen. Während dieser Zeit wurde der Kolben aus dem Inkubator genommen und alle 30 Minuten leicht geschüttelt. Am Ende dieser Verfahren wurde das Erhaltungsmedium (MEM mit 1 % FBS) vorbereitet und hinzugefügt, bis ein Gesamtvolumen von 10 ml erreicht war. Der CPE (zytopathische Effekt) wurde 3 bis 7 Tage lang beobachtet, und wenn der CPE bestätigt wurde, wurde die Probe tiefgefroren gelagert, um drei Gefrier-Tau-Zyklen durchzuführen. Alle HCoV-229E-Virussuspensionen wurden in 50 ml eines konischen Röhrchens gesammelt und 10 Minuten lang bei 4000 × g und 4 °C zentrifugiert. Abschließend wurde der Überstand mit einem 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert, um das Zellpellet zu entfernen, und vor der Verwendung in den Experimenten im Tiefkühlschrank bei -80 °C gelagert.

Zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit wurde der MTT-Assay [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] unter Verwendung von Kaffeesäure und Vanillin durchgeführt. MRC-5-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/100 µL in einer 96-Well-Platte ausgesät, und nach 24 Stunden wurde das alte Medium entfernt und durch neues Zellkulturmedium mit verschiedenen Konzentrationen (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100 µmol) Naturstoffe. Das MTT-Reagenz wurde alle 3 Stunden vor jedem Experiment hinzugefügt, 15 Minuten lang sanft geschüttelt und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert, um Formazan zu erzeugen. Nach Entnahme der Wellplatte zum genauen Versuchszeitpunkt wurde das Medium entfernt, 100 µL DMSO in jedes Well gegeben und das Formazan durch Pipettieren mit geeigneter Geschwindigkeit aufgelöst. Die Messung der optischen Dichte wurde mit einem Spektrophotometer (Spectra Max 190, Sunnyvale, USA) bei 460 nm durchgeführt. Der Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit wurde anhand der folgenden Formel berechnet:

Zelllebensfähigkeit (%) = [Numerischer OD-Wert – Blindwert / Kontroll-OD-Wert – Blindwert] × 100.

Es wurden ein Produkt auf der Basis von 70 % Ethanol (AMOREPACIFIC CO., LTD, Seoul, Korea) und ein Produkt auf der Basis von 70 % Isopropylalkohol (Green Pharmaceutical., LTD, Seoul, Korea) gekauft. Ein 10 %iges Produkt auf Benzalkoniumchloridbasis (Green Pharmaceutical., LTD) wurde gekauft und auf eine Konzentration von 0,066 % verdünnt.

Alle diese Händedesinfektionsmittel wurden auf ihre viruzide Wirkung gegen HCoV-229E als Ersatz für SARS-CoV-2 getestet. Dabei wurde ein leicht modifiziertes Protokoll der europäischen Norm EN14476 verwendet, um den Reduktionswert in Suspension zu quantifizieren. Zunächst wurde das handelsübliche Händedesinfektionsmittel 30 s lang gevortext und ein 800-µL-Aliquot in ein 1,5-ml-EP-Röhrchen überführt. Dann wurden 100 µL 0,3 g/L Rinderserumalbumin (BSA) langsam zu 100 µL Virussuspension gegeben, um das Endvolumen auf 1 ml einzustellen, und die Mischung wurde 0,5, 1, 2, 3 lang mit dem Händedesinfektionsmittel behandelt , und 5 Min. Während dieser Behandlungszeit wurden die Lösungen durch Pipettieren kräftig gemischt. Nach Ablauf jeder Behandlungszeit wurde ein 100-µL-Aliquot entnommen und mit 900 µL MEM + 1 % FBS gemischt, um die Testsubstanzen zu neutralisieren. Abschließend wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt und das Virus inokuliert, um den Virustiter zu berechnen.

Formulierte Händedesinfektionsmittel wurden unter Anwendung leicht modifizierter WHO-Protokolle für selbstgemachte Händedesinfektionsmittel hergestellt (Tabelle 1). Alkohol (99,9 %) (DAEJUNG CO., LTD, Siheung, Korea), Isopropylalkohol (99,5 %) (JUNSEI CO., LTD, Japan) und Benzalkoniumchlorid (10 %) (Green Pharmaceutical., LTD, Seoul, Korea). ) wurden gekauft und direkt mit Glycerin, Propylenglykol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, ACS-Reagenz, 99,5 %) und autoklaviertem destilliertem Wasser gemischt. Der pH-Wert der drei Händedesinfektionsmittel wurde durch Zugabe von 1 M Natriumhydroxid und 1 N Salzsäure eingestellt. Schließlich wurden alle Händedesinfektionsmittel durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, der an einem 250-ml-Vorratsflaschensystem angebracht war, um Kontaminationen zu verhindern und Ablagerungen zu entfernen.

Als antivirale Substanzen wurden Kaffeesäure (Sigma-Aldrich, 98,0 % HPLC) und Vanillin (Sigma-Aldrich, ReagentPlus®, 99 %) verwendet. Als Lösungsmittel wurde Ethanol (100 ml) verwendet. Kaffeesäure (108,1 mg) und Vanillin (152,15 mg) wurden in Ethanol gelöst, um Lösungen mit 6.000 und 10.000 µmol/ml herzustellen. Abschließend wurde 1 ml der vorbereiteten Lösung zum formulierten Händedesinfektionsmittel gegeben, um das Gesamtvolumen auf 100 ml einzustellen. Die experimentelle Methode ist die gleiche wie bei der Herstellung eines handelsüblichen Händedesinfektionsmittels.

Frische Schweinehaut wurde auf einem lokalen Markt in Anseong, Korea, gekauft. Die Schweinehaut wurde zweimal mit Leitungswasser und destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Schweinehaut leicht getrocknet und mit einem sterilisierten Messer in 2 × 2 cm große Quadrate geschnitten. Anschließend legten wir die Schweinehautstücke in sterile Petrischalen und bestrahlten sie 15 Minuten lang auf der epidermalen und dermalen Seite mit UV-Licht.

Die Proben wurden zur reibungslosen Inokulation auf eine 6-Well-Platte übertragen. Die HCoV-229E-Virussuspension (100 µL, 7,0 log TCID50/ml) wurde auf der epidermalen Seite punktuell inokuliert und die Suspension zur Virusadhäsion mit einer Pipettenspitze verteilt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden 800 µL des formulierten Händedesinfektionsmittels und 100 µL BSA auf jede Probe aufgetragen, um das Gesamtvolumen auf 1 ml einzustellen. Jede Behandlung wurde 0,5, 1, 2, 3 und 5 Minuten lang durchgeführt und die Proben wurden sofort entnommen und in 2 ml 1 % FBS + MEM-Lösung eingeweicht, um das Händedesinfektionsmittel zu neutralisieren. Das Virus wurde durch einminütiges Vortexen gewonnen. Abschließend wurde die Probe mit einem 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert und die gewonnene Suspension zur Messung des Virustiters beimpft.

Als primäre Beschichtungssubstanz wurde Polymilchsäure (PLA) (Goodfellow., LTD, England) verwendet. Als Lösungsmittel wurde Chloroform (Sigma Aldrich, 99,5 %) verwendet, da es die höchste Löslichkeit ergab. Ein Magnetstab wurde in ein 500-ml-Becherglas gegeben, mit Aluminiumfolie abgedeckt und 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. PLA-Granulat wurde 1 bis 2 Stunden lang mit Chloroform gemischt, um eine Konzentration von 7,6 % (Gew./Vol.) zu erreichen. Das Mischen wurde gestoppt, als visuell bestätigt wurde, dass die PLA-Partikel vollständig geschmolzen waren.

Als antivirale Substanzen wurden Kaffeesäure und Vanillin eingesetzt. Kaffeesäure (108,1 mg) und Vanillin (152,15 mg) wurden in 10 ml Ethanol gelöst, um Lösungen mit 6.000 und 10.000 µmol/ml herzustellen. Anschließend wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt, um die entsprechenden 600- und 1000-µmol/ml-Lösungen herzustellen. Schließlich wurden 10 ml dieser Lösung mit 90 ml der PLA-Beschichtungslösung gemischt, um das Gesamtvolumen auf 100 ml einzustellen, 1 bis 2 Stunden lang kräftig gerührt und 10 ml in quadratische Edelstahlrahmen gegossen. Die Proben wurden 2 bis 3 Tage lang bei 50 bis 60 °C getrocknet, um thermodynamische Eigenschaften zu erhalten.

Die Wirksamkeit des antiviralen Films wurde mit der Methode von Butot und Mitarbeitern [9] bewertet, mit geringfügigen Modifikationen basierend auf ISO 21.702, um die antivirale Wirkung auf Kunststoff- und nicht porösen Oberflächen zu messen. Die Beschichtung wurde mit einer sterilisierten Schere in 2 × 2 Quadrate geschnitten und 5 Minuten lang in 70 %iges Ethanol getaucht, um Rückstände zu entfernen. Dann wurde Whatman-Filterpapier Nr. 4 auf eine Petrischale gelegt, drei Filme übereinander gelegt und die Filme 15 Minuten lang hin und her getrocknet. Anschließend wurden 25 µL HCoV-229E-Virussuspension auf jede Beschichtung geimpft und 30 Minuten lang getrocknet, um die Virusadhäsion sicherzustellen. Dann wurden reine PLA (NP), mit 60 µmol Kaffeesäure versetzte PLA (CP) und 100 µmol Vanillin versetzte PLA (VP) Filmproben 2 Stunden lang in Abständen von 30 Minuten gegen HCoV-229E getestet.

Sobald jede Verarbeitungszeit abgelaufen war, wurden die Proben in 1 ml 1 %iger FBS + MEM-Lösung eingeweicht und das Virus durch einminütiges Vortexen gewonnen. Schließlich wurde die gewonnene Suspension geimpft, um den Virustiter zu messen.

Die Methoden zur Vorbereitung der Schweinehaut- und Filmproben waren die gleichen wie bei der Bewertung der Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln in Schweinehaut bzw. antiviralen PLA-Filmen gegen HCoV-229E-Suspension. Nachdem jeder der drei antiviralen Filme und Schweinehautproben auf eine Petrischale gelegt wurde, wurden 25 µL HCoV-229E-Suspension auf die Epidermisschicht der Haut geimpft. Anschließend wurde die virusinokulierte Epidermis vorsichtig mit einer sterilisierten Pinzette aufgenommen und mit jedem vorbereiteten Film 10 und 50 Mal im Abstand von 30 Minuten 2 Stunden lang gerieben. Dabei stellen 50 Reibungen die maximale Anzahl von Kontakten im Tagesdurchschnitt auf stark berührten Oberflächen dar und 10 Reibungen stellen eine geringe Kontakthäufigkeit dar.

Nachdem die Anzahl der Reibungen abgeschlossen war (alle 30 Minuten), wurde die Probe sofort in 1 ml 1 %iger FBS + MEM-Lösung eingeweicht und dann wurde das Virus durch 1-minütiges Vortexen gewonnen. Abschließend wurde die Probe mit einem 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert und die gewonnene Suspension zur Messung des Virustiters beimpft.

Eine ATR-FTIR-Analyse wurde durchgeführt, um die Konjugation der mit antiviralem Vanillin (VP) und Kaffeesäure beschichteten (CP) Filme auf den PLA-Oberflächen zu überprüfen. Die Oberflächen wurden auf die gleiche Weise vorbereitet, wie bei der Herstellung einer antiviralen Folie unter Verwendung von PLA und natürlichen Substanzen beschrieben. Die Spektren wurden mit einem Nicolet iS10 FT-IR-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zwischen 4000 und 400 cm−1 Wellenlängen ohne zusätzliche Probenvorbereitung gemessen. Verschiedene beschichtete Proben wurden an fünf zufälligen Stellen mit einer Spitze-zu-Spitze-Auflösung von 0,5 cm−1 pro Spektrum analysiert. Für jedes Spektrum wurden 32 Scans mit einer Spitze-zu-Spitze-Auflösung von 4 cm− 1 kombiniert. Nach der Behandlung wurden die Daten mit einer 64-Bit-Hochleistungs-FT-IR-Software aufgezeichnet. Dokumentierte Daten wurden abgeglichen und die Wellenzahlen der Hauptspektren wurden von der OMNIC™ Spectra Software (Thermo Fisher Scientific) im Transmissionsmodus (%T) erfasst [42].

In allen Experimenten wurde der HCoV-229E-Titer mithilfe des Gewebekultur-Infektionsdosistests berechnet. Kurz gesagt, MRC-5-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/100 µL in einer 96-Well-Platte ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert, bis unter dem Mikroskop eine Dichte von 50 % beobachtet wurde. Nach 24 Stunden wurde das Zellkulturmedium verworfen und einmal mit DPBS gewaschen. Die Virusprobe wurde mit einer 10-fachen Reihenverdünnung unter Verwendung von 1 % FBS des MEM-Zellkulturmediums hergestellt und beimpft. Die beimpfte 96-Well-Platte wurde 5 Tage lang bei 33 °C mit 5 % CO2 inkubiert, um den CPE mit einem Mikroskop zu bestimmen. Der CPE wurde mit der Reed-Muench-Methode (auch bekannt als Logarithmendifferenz) berechnet:

Differenz der Logarithmen = [(Mortalität bei einer Verdünnung knapp über 50 %) – 50 %] / [(Mortalität knapp über 50 %) – (Mortalität knapp unter 50 %)]

Die Experimente wurden unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung mit mindestens drei Proben durchgeführt. Die Ausdrücke des Virustiters wurden als logarithmische Funktionen berechnet (log TCID50/ml in Suspension und Schweinehaut). Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. IBM SPSS Statistics Version 26 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) wurde verwendet, um Duncans Mehrfachbereichstest und die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchzuführen. Die Grafiken wurden mit Sigma-Plot Version 10.0 (Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA) erstellt. Signifikante Unterschiede zwischen der Behandlungszeit des Händedesinfektionsmittels und der Folie wurden mit p < 0,05 ermittelt.

Abbildung 1 zeigt die Wirksamkeit von kommerziellen Händedesinfektionsmitteln auf Ethanol-, Isopropylalkohol- und Benzalkoniumchloridbasis gegen HCoV-229E in Suspension. Der anfängliche Titer von HCoV-229E betrug 6,1 log TCID50/ml. Das kommerzielle Desinfektionsmittel mit 70 % Ethanol zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 2,5, 3,0, 4,6 und 5,0 log10 TCID50/ml für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ mL) wurde jeweils nach 5 Minuten Behandlung beobachtet.

Inaktivierung von HCoV-229E in Suspension durch handelsübliche Händedesinfektionsmittel. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen der Mittelwerte (SD) dar. AE weisen auf signifikante Unterschiede (p < 0,05) je nach Behandlungszeit hin. Die kurze gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (0,5 log TCID50/ml).

Das Desinfektionsmittel mit 70 % Isopropylalkohol zeigte logarithmische Reduktionswerte von 4,5, 4,7 und 5,5 für 0,5, 1 und 2 Minuten, und nach 3-minütiger Behandlung wurde kein CPE beobachtet (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml).

Das auf eine Konzentration von 0,066 % verdünnte Produkt auf Benzalkoniumchloridbasis zeigte logarithmische Reduktionswerte von 3,6, 3,7, 4,0 und 4,4 für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten, und es wurde kein CPE beobachtet (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ ml) nach 5 Minuten Behandlung.

Abbildung 2 zeigt die Wirksamkeit der formulierten Händedesinfektionsmittel auf Ethanol-, Isopropylalkohol- und Benzalkoniumchloridbasis gegen HCoV-229E in Suspension. Der anfängliche Titer von HCoV-229E betrug 6,5 log TCID50/ml. Das formulierte Händedesinfektionsmittel mit 70 % Ethanol zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 3,2, 3,8, 4,6 und 5,5 log TCID50/ml für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten und keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml). wurde jeweils nach 5 Minuten Behandlung beobachtet. Das 70 %ige Isopropylalkoholprodukt zeigte logarithmische Reduktionswerte von 4,8, 5,1, 5,7 und 5,8 für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten, und nach 5 Minuten Behandlung wurde kein CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml) beobachtet .

Inaktivierung von HCoV-229E in Suspension durch formulierte Händedesinfektionsmittel. Der Fehlerbalken stellt Standardabweichungen der Mittelwerte (SD) dar. AE weisen auf signifikante Unterschiede (p < 0,05) zwischen den einzelnen Händedesinfektionsmitteln je nach Behandlungsdauer hin. Die kurze gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (0,5 log TCID50/ml).

Formulierte Benzalkoniumchloridprodukte, die auf eine Konzentration von 0,066 % verdünnt wurden, zeigten logarithmische Reduktionswerte von 3,1, 4,4, 4,8 und 5,1 für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten, und das Ergebnis der 5-minütigen Behandlungsgruppe war das gleiche wie das von die beiden oben genannten Desinfektionsmittel. (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml)

Der MTT-Assay wurde durchgeführt, um die optimale Konzentration von Kaffeesäure und Vanillin zu bestimmen, die eine antivirale Aktivität bieten kann, ohne zytotoxische Wirkungen zu zeigen. Abbildung 3 zeigt, dass Kaffeesäure und Vanillin die Proliferation von MRC-5-Zellen bei Konzentrationen über 60 µmol bzw. 100 µmol über einen Zeitraum von 5 Behandlungstagen unterdrücken. Wenn Kaffeesäure und Vanillin in Mengen von 60 µmol und 100 µmol über 5 Tage verabreicht wurden, blieb die Lebensfähigkeit der MRC-5-Zellen über 80 %.

Zytotoxizität von MRC-5 in verschiedenen Konzentrationen durch Kaffeesäure (A) und Vanillin (B). Die kurze gestrichelte Linie zeigt die 80 % der Zelllebensfähigkeit in jeder Kaffeesäure- und Vanillinkonzentration an

Abbildung 4 A, B und C zeigt die Wirksamkeit von natürlichen Substanzen, die formulierten Händedesinfektionsmitteln zugesetzt werden, gegen HCoV-229E in Suspension. Der anfängliche Titer von HCoV-229E betrug 6,5 log TCID50/ml.

Vergleich der Wirksamkeit der formulierten Händedesinfektionsmittel mit Naturstoffen gegenüber Suspensionen. (A), (B) und (C) stehen für Ethanol, Isopropylalkohol bzw. Benzalkoniumchlorid. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen der Mittelwerte (SD) dar. AE weisen auf signifikante Unterschiede (p < 0,05) je nach Behandlungszeit hin. Die gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (0,5 log TCID50/ml)

Das formulierte Händedesinfektionsmittel mit 70 % Ethanol zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 3,2, 3,8, 4,6 und 5,5 log TCID50/ml für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten und keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml). wurde nach 5 Minuten Behandlung beobachtet. Das mit 70 % Ethanol und 60 µmol Kaffeesäure hergestellte Desinfektionsmittel zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 4,0, 4,4 und 5,7 für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50). /ml) wurde nach 3 Minuten Behandlung beobachtet. Das formulierte 70 %ige Ethanol-Händedesinfektionsmittel mit 100 µmol Vanillin zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 3,9, 4,7 und 5,0 Log für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 Log TCID50). /ml) wurde nach 3 Minuten Behandlung beobachtet. Das formulierte 70 %ige Isopropylalkoholprodukt zeigte logarithmische Reduktionswerte von 4,8, 5,1, 5,7 und 5,8 für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten, und für eine 5-minütige Behandlung wurde kein CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml) beobachtet . Das mit 70 % Isopropylalkohol und 60 µmol Kaffeesäure formulierte Produkt zeigte eine 5,7-log-Reduktion für 0,5-minütige Behandlung und nach 1-minütiger Behandlung wurde kein CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml) beobachtet. Das mit 70 % Isopropylalkohol und 100 µmol Vanillin formulierte Produkt zeigte einen logarithmischen Reduktionswert von 5,6 für 0,5 Minuten Behandlung und nach 1 Minute Behandlung wurde kein CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml) beobachtet.

Das auf 0,066 % verdünnte Benzalkoniumchlorid-Desinfektionsmittel zeigte logarithmische Reduktionswerte von 3,1, 4,4, 4,8 und 5,1 für 0,5, 1, 2 und 3 Minuten Behandlung. Das mit 0,066 % Benzalkoniumchlorid und 60 µmol Kaffeesäure formulierte Produkt zeigte logarithmische Reduktionswerte von 4,6, 4,7, 5,1 und 5,7 für 0,5, 1, 2 bzw. 3 Minuten Behandlung. Das mit 0,066 % Benzalkoniumchlorid und 100 µmol Vanillin formulierte Produkt zeigte logarithmische Reduktionswerte von 4,5, 4,6, 5,2 und 5,4 für 0,5, 1, 2 bzw. 3 Minuten Behandlung.

Alle formulierten Händedesinfektionsmittel auf Benzalkoniumchloridbasis, die natürliche Substanzen enthielten, zeigten nach 5-minütiger Behandlung keinen CPE (Nachweisgrenze: 0,5 log TCID50/ml).

Abbildung 5 A, B und C zeigt die Wirksamkeit formulierter Händedesinfektionsmittel mit natürlichen Substanzen gegen HCoV-229E auf Schweinehaut.

Vergleich der Wirkungen natürlicher Substanzen in formulierten Händedesinfektionsmitteln auf Schweinehaut. (A), (B), (C) stehen für Ethanol, Isopropylalkohol bzw. Benzalkoniumchlorid. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen der Mittelwerte (SD) dar. AE weisen auf signifikante Unterschiede (p < 0,05) je nach Behandlungszeit hin. Die gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (1,0 log TCID50/ml)

Der anfängliche Titer von HCoV-229E betrug 7,0 log TCID50/ml und es wurden 4,8 log TCID50/ml wiedergewonnen. Das formulierte 70 %-Ethanol-Produkt zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 2,0, 2,5 und 2,8 für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung, und nach 3 Minuten Behandlung wurde eine 3,3-Log-Reduktion beobachtet. Das mit 70 % Ethanol und 60 µmol Kaffeesäure formulierte Produkt zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,4, 2,6 und 3,2 für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml). wurde nach 3 Minuten Behandlung beobachtet. Das mit 70 % Ethanol und 100 µmol Vanillin formulierte Desinfektionsmittel zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,1, 2,5, 3,0 und 3,4 für 0,5, 1, 2 bzw. 3 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ mL) wurde nach 5 Minuten Behandlung beobachtet.

Das formulierte 70-prozentige Isopropylalkoholprodukt zeigte HCoV-229E-Log-Reduktionswerte von 2,1, 2,4 und 3,0 für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung, und eine 3,3-Log-Reduktion wurde nach 3 Minuten Behandlung beobachtet (Nachweisgrenze: 1,0). log TCID50/ml). Das mit 70 % Isopropylalkohol und 60 µmol Kaffeesäure formulierte Desinfektionsmittel zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,6, 2,7 und 3,3 für 0,5, 1 bzw. 2 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml). wurde nach 3 Minuten Behandlung beobachtet. Das mit 70 % Isopropylalkohol und 100 µmol Vanillin formulierte Desinfektionsmittel zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,5, 2,7, 3,0 und 3,5 für 0,5, 1, 2 bzw. 3 Minuten Behandlung und keinen CPE (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50). /ml) wurde nach 5 Minuten Behandlung beobachtet.

Das 0,066 % Benzalkoniumchlorid-Produkt zeigte logarithmische Reduktionswerte auf Schweinehaut von 2,0, 2,2, 2,6, 3,1 und 3,1 für 0,5, 1, 2, 3 bzw. 5 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml). Das 0,066 %ige Desinfektionsmittel auf Benzalkoniumchloridbasis mit 60 µmol Kaffeesäure zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,1, 2,5, 2,8, 3,1 und 3,3 für 0,5, 1, 2, 3 bzw. 5 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log). TCID50/ml). Das 0,066 %ige Desinfektionsmittel auf Benzalkoniumchloridbasis mit 100 µmol Vanillin zeigte logarithmische Reduktionswerte von 2,0, 2,3, 2,7, 3,1 und 3,2 für 0,5, 1, 2, 3 bzw. 5 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50). /ml).

Die mit Vanillin (VP) und Kaffeesäure (CP) beschichteten PLA-Folien wurden mittels ATR-FTIR analysiert und mit den Reinsubstanzen verglichen. Für den Datenvergleich wurde eine verifizierte Referenzbibliothek aus früheren Studien verwendet und die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. PLA wies drei verschiedene funktionelle Gruppen auf, die als Carboxyl-, Phenol- und amorphe kristalline Regionen in reiner Form identifiziert wurden und sich bei 1748,7 und 1180,4, 1130, befanden –1041,3 und 868,6–753,9 cm− 1 (Abb. 6A). Nach der Vanillinbeschichtung auf der PLA-Oberfläche wurde die identische Carboxylgruppe von PLA bei 1747,93 cm− 1 gefunden. Die –C = O-Streckbindungen wurden im beschichteten Film beobachtet, der ähnliche Spektren wie reines Vanillin aufwies. Darüber hinaus wurden konjugierte Wechselwirkungen bei 1586–1509,4 cm− 1 beobachtet. Die reine Form von Vanillin wurde jedoch nicht auf der beschichteten Oberfläche nachgewiesen. Darüber hinaus wurden Hydroxyl-Streckungen und damit verbundene Verformungen an derselben Position wie im Vanillin-Spektrum (3186,2 cm− 1) nachgewiesen (Abb. 6A). Nach der Beschichtung von PLA mit Kaffeesäure wurden ähnliche Carboxylgruppen wie bei PLA nachgewiesen (Tabelle 2; Abb. 6B). Konjugierte Wechselwirkungen wurden bei 1590,1, 1454,3, 1429,4, 1298,8, 1265,5 und 1126,7 cm−1 gefunden. Ähnlich wie bei PLA wurden auch Carboxylgruppen (1747,7 cm−1) und Phenolgruppen (1180,2 cm−1) nachgewiesen. Darüber hinaus waren die Hydroxyl-Streckung und die Phenol-/Carbon-Verformungen die gleichen wie in reiner Kaffeesäure (3185,5 bzw. 860,7 cm−1) (Abb. 6B).

ATR-FTIR-Analyse der (A) mit Vanillin beschichteten PLA-Folien und (B) der mit Kaffeesäure beschichteten Folien. Jedes Alphabet steht für (a) reines Vanillin und reine Kaffeesäure, (b) PLA-Folie und (c) mit Vanillin beschichtete PLA-Folie und Kaffeesäure-PLA-Folie. Unterschiedliche Zahlen (1–5) geben die Hydroxyl-, Carboxyl-, konjugierte Wechselwirkung, phenolische, amorphe Region und phenolische/carboxylische funktionelle Gruppen an

Abbildung 7 zeigt die Wirksamkeit von PLA und natürlichen Substanzen, die PLA-Folien zugesetzt werden, gegen die HCoV-229E-Suspension. Der anfängliche Titer von HCoV-229E betrug 5,3 log TCID50/ml, und 0 Minuten nach dem Trocknungsprozess wurden auf jedem PLA-Film 4,3, 3,3 und 3,5 log TCID50/ml wiedergewonnen.

Vergleich der Wirksamkeit von PLA-Folien mit reinem PLA (NP) und mit natürlichen Substanzen (CP, VP) versetzt gegen Suspension. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung der Mittelwerte (SD) dar. AD weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,05) der einzelnen antiviralen Filme nach Behandlungsdauer hin. ac zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen NP und VP, CP in jeder Behandlungszeitgruppe an. (p<0,05) Die kurze gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (1,0 log TCID50/ml)

Im reinen PLA-Film (NP) betrug der Titer von HCoV-229E 4,2, 4,0, 3,6 und 3,3 log für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml). Im Vergleich zur NP als Kontrollgruppe zeigte die CP logarithmische Reduktionswerte von 1,2, 1,2, 1,0 und 1,0 log für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml).

Der VP zeigte logarithmische Reduktionswerte von 0,9, 1,0, 0,9 und 0,7 für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung (Nachweisgrenze: 1,0 log TCID50/ml).

Als Ersatzmodell für menschliche Haut wurde Schweinehaut verwendet, um die antiviralen Eigenschaften der PLA-Folie in Abhängigkeit vom Vorhandensein natürlicher Substanzen und der Anzahl der Kontakte zwischen Folie und Haut zu untersuchen. Darüber hinaus wurden die Reibungsbedingungen und der Virusverlust aufgrund der Häufigkeit von Oberflächenkontakten berücksichtigt.

Die Ergebnisse der Reibung und des Virusverlusts aufgrund von zehnmaligem Oberflächenkontakt sind in Abb. 8A dargestellt. Im reinen PLA-Film nahm der Virustiter mit zunehmender Anzahl der Reibungen und zunehmender Zeit ab. Der anfängliche Virustiter betrug 6,1 log TCID50/ml und nach 0 Minuten wurden nach 10-maligem Reiben 4,2 log TCID50/ml des Virus wiedergewonnen. Nach 10-maligem Einreiben der Schweinehaut zeigten die Virustiter Werte von 3,6, 3,1, 2,8 und 2,4 log für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung.

Vergleich der antiviralen Wirkungen anhand der Anzahl der Kontakte auf Schweinehaut. (A) und (B) stellen die Wirksamkeit von reinem, mit Kaffeesäure und Vanillin versetztem PLA-Film anhand der Kontaktzeiten auf Schweinehaut dar. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen der Mittelwerte (SD) dar. AE weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,05) der einzelnen antiviralen Filme nach Behandlungsdauer hin. ac zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen NP und CP, VP in jeder Behandlungszeitgruppe an. (p<0,05) Die kurze gestrichelte Linie gibt die Nachweisgrenze an (1,0 log TCID50/ml)

Antivirale Filme mit natürlichen Substanzen zeigten bei 10-maligem Kontakt signifikante Unterschiede in der Wirksamkeit im Vergleich zu den meisten NP-Gruppen und den Behandlungszeitgruppen. Bei CP betrug der anfängliche Virustiter 6,1 log TCID50/ml und nach 0 Minuten wurden nach 10 Reibungen 3,4 log TCID50/ml des Virus wiedergewonnen. Die Wirksamkeit der vorbereiteten Filme wurde mit der des NP als Kontrolle verglichen. Als jede Probe zehnmal mit dem CP eingerieben wurde, zeigte der Virustiter logarithmische Reduktionen von 0,3, 0,6, 0,8 und 1,1 für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung. Ebenso zeigte VP die gleiche antivirale Tendenz wie CP. Der anfängliche Virustiter betrug 6,1 log TCID50/ml und nach 0 Minuten wurden nach 10 Reibungen 3,7 log TCID50/ml des Virus wiedergewonnen. Die Wirksamkeit der vorbereiteten Filme wurde mit NP als Kontrolle verglichen. Wenn jede Probe zehnmal mit dem VP eingerieben wurde, betrugen die logarithmischen Reduktionen 0,2, 0,5, 0,6 und 0,9 für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung.

Allerdings zeigten die antiviralen PLA-Folien mit natürlichen Substanzen im Vergleich zu den 10-mal geriebenen Gruppen in den 50-mal geriebenen Gruppen eine relativ geringe Wirkung auf den Virustiter. Die Wirksamkeit von PLA-Filmen mit 50-maligem Reiben gegen die HCoV-229E-Suspension ist in Abb. 8B dargestellt. Im NP betrug der anfängliche Virustiter 6,1 log TCID50/ml und nach 0 Minuten wurden nach 50 Reibungen 4,0 log TCID50/ml des Virus wiedergewonnen. Nach 50-maligem Einreiben der Schweinehaut zeigten die Virustiter Werte von 3,4, 2,7, 2,5 und 2,0 log für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung. Bei CP und VP betrug der anfängliche Virustiter 6,1 log TCID50/ml und bei 0 Minuten wurden nach 50 Reibungen 3,6 log TCID50/ml des Virus wiedergewonnen. Die Wirksamkeit der vorbereiteten Filme wurde mit NP als Kontrolle verglichen. Als jede Probe 50-mal mit CP und VP gerieben wurde, zeigte der Virustiter logarithmische Reduktionen von 0,08, 0,1, 0,4 und 0,3 bzw. 0,04, 0,03, 0,3 und 0,2 für 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten Behandlung .

Kommerzielle Händedesinfektionsmittel auf Basis von Ethanol, Isopropylalkohol und Benzalkoniumchlorid wurden anhand ihrer Verkaufsrangliste in Korea ausgewählt. Alle Händedesinfektionsmittel mussten die Leistungsstandards der Europäischen Norm (EN) 14.476 erfüllen, die eine Reduzierung um 4 log innerhalb von 2 Minuten vorsehen [49]. Daher wurden die in dieser Studie verwendeten kommerziellen Desinfektionsmittel unter Anwendung des Protokolls EN 14.476 bewertet, um den logarithmischen Reduktionswert in Suspension zu quantifizieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten Werte über 4 Log innerhalb von 2 Minuten. Diese Ergebnisse stimmen mit Inaktivierungsexperimenten gegen SARS-CoV-2 unter Verwendung handelsüblicher Desinfektionsmittel auf Alkoholbasis überein, die innerhalb von 30 s Werte über 3 log gezeigt haben. Darüber hinaus haben kommerzielle Produkte auf Isopropyl- und Benzalkoniumchloridbasis ähnliche Ergebnisse gegen SARS-CoV-2 gezeigt (Reduktionen über 3 log innerhalb von 30 s) [13, 50]. Die in dieser Studie formulierten Händedesinfektionsmittel aus Ethanol, Isopropylalkohol und Benzalkoniumchlorid wurden auch anhand des Protokolls EN 14.476 bewertet. Diese Produkte reduzierten den Virustiter innerhalb von 2 Minuten um mehr als 4 log. Insbesondere Isopropylalkohol zeigte in den 30-s-Behandlungsgruppen eine größere Wirksamkeit bei der Reduzierung des Virustiters als Ethanol und Benzalkoniumchlorid (Reduzierung des Titers um 1,5 bzw. 1,6 log). Dies stimmt mit einer früheren Studie überein [51], in der erwähnt wurde, dass Isopropylalkohol in seiner Summenformel eine Kohlenstoffgruppe mehr als Ethanol aufweist, was zur Inaktivierung der lipophilen und umhüllten Strukturen von SARS-CoV-2 beiträgt.

Da Händedesinfektionsmittel zur Reinigung der Haut der Hände verwendet werden, wurde Schweinehaut als Ersatzmodell für menschliche Haut verwendet, um die Wirksamkeit der Händedesinfektionsmittel zu bewerten. Schweinehaut ähnelt histologisch der menschlichen Haut und wurde in mehreren Studien zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe verwendet. Daher wird erwartet, dass Schweinehaut ähnliche Ergebnisse liefert wie menschliche Haut. In einer früheren Studie [52], in der die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln auf der Haut von Schweinen untersucht wurde, zeigte ein Haut- und Wundreiniger auf Ethanolbasis (AWC2) eine Reduzierung um 3 log für eine 5-minütige Behandlung nach einer Inokulation mit 6 log PFU/ml SARS-CoV-2 . Ebenso zeigte die vorliegende Studie einen Rückgang um 3 log, wenn die Haut 3 Minuten lang behandelt wurde. Dennoch betrug die Abnahme selbst nach 10-minütiger Behandlung mit dem AWC2-Desinfektionsmittel weniger als 0,5 log [52]. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Studie nach 3 Minuten keine Änderung des Reduktionswerts beobachtet. Diese Ergebnisse können auf die Verwendung des Desinfektionsmittels in Gegenwart organischer Stoffe wie Serum oder Protein zurückzuführen sein, die die antivirale Wirkung behindern [53]. Daher verringerten organische Substanzen in der Schweinehaut die Desinfektionskraft signifikant (p > 0,05), was erklären könnte, warum die antivirale Wirkung der in dieser Studie formulierten Händedesinfektionsmittel nach 3 Minuten aufhörte.

Mehrere Untersuchungen konzentrierten sich auf die signifikanten antiviralen Eigenschaften natürlicher Verbindungen, die hauptsächlich duftende und biologische Eigenschaften von Pflanzen besitzen. Es handelt sich um komplexe Gemische aus lipophilen und flüchtigen Sekundärmetaboliten. Es gibt mehrere Gruppen pflanzlicher antimikrobieller Mittel, darunter Phenolverbindungen, Saponine, Thiosulfinate, Glucosinolate, Terpenoide und Isoflavonoide [54]. Der Großteil der antiviralen Studien konzentrierte sich auf umhüllte Viren, während nur begrenzte Untersuchungen zur Wirksamkeit dieser natürlichen Verbindungen gegen nicht umhüllte Viren durchgeführt wurden. Daher ist wenig über die antivirale Wirkung natürlicher Verbindungen wie ätherischer Öle und Pflanzenextrakte gegen unbehüllte Viren bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass unbehüllte Viren resistenter gegenüber Umweltbedingungen und der Wirkung antimikrobieller Mittel sind als umhüllte Viren [55]. Verschiedene natürliche Verbindungen können das Virus inaktivieren, indem sie in die Struktur der Virionhülle des umhüllten Virus eingreifen oder an der Wirtszelle adsorbieren, während das Proteinkapsid des nicht umhüllten Virus die Nukleinsäure des Virus schützt und die Adsorption des Virus verhindert zur Wirtszelle. Eine Beeinträchtigung des Eintritts kann die Effizienz der Virusinaktivierung verringern [56]. stellte fest, dass die Anwendung ätherischer Öle das murine Norovirus und das humane Adenovirus, die beide unbehüllte Viren sind, nicht wirksam inaktivieren konnte, und kam zu dem Schluss, dass ätherische Öle keine Alternative zur Reduzierung oder Eliminierung unbehüllter Viren in der Lebensmittelindustrie darstellen. In jüngerer Zeit [57] wurde die antivirale Aktivität von pflanzlichen Produkten untersucht, darunter schwarzer Apfelbeer-, Holunder- und Granatapfelsaft sowie grüner Tee gegen das surrogatmodifizierte Vacciniavirus Ankara und SARS-CoV-2, das Influenza-A-Virus (IAV). ) und Adenovirus Typ 5. Obwohl ihre antivirale Wirksamkeit unterschiedlich war, da die Zusammensetzung der einzelnen natürlichen Verbindungen unterschiedlich war, wurden die getesteten natürlichen Verbindungen jedoch am meisten von Viren reduziert, mit Ausnahme des Adenovirus Typ 5, bei dem es sich um ein nicht umhülltes Virus handelt, das weniger anfällig für Viren war Die getesteten natürlichen Verbindungen haben jedoch auch einige antivirale Wirkungen auf kleine Darmviren wie menschliches Norovirus, murines Norovirus-1, Rotavirus und Adenovirus festgestellt. Es wurde festgestellt, dass sie eine gewisse Wirkung auf das Virus haben, indem sie in gewissem Maße auf das Proteinkapsid einwirken dieser Viren [58].

Obwohl keine Untersuchungen zur Bewertung der Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln mit Kaffeesäure und Vanillin durchgeführt wurden, wurde ein Experiment durchgeführt, um die synergistische Wirkung natürlicher Substanzen und der damit hergestellten Händedesinfektionsmittel gegen HCoV-229E zu bestimmen. Als Ergebnis zeigten Händedesinfektionsmittel, die Kaffeesäure und Vanillin enthielten, einen Virustiter, der bis zur Nachweisgrenze reduziert wurde, selbst in Experimenten mit Schweinehaut, und die Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze wurde für die Virussuspension verkürzt. In der vorliegenden Studie wurde die Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze des Virustiters in Suspension von 5 auf 3 Minuten für Ethanol und von 5 Minuten auf 1 Minute für Isopropylalkohol verkürzt, nachdem den Händedesinfektionsmitteln natürliche Substanzen zugesetzt wurden. Darüber hinaus inaktivierten Ethanol- und Isopropylalkoholprodukte, die Kaffeesäure enthielten, HCoV-229E in 3 Minuten, wenn Händedesinfektionsmittel mit natürlichen Substanzen auf die Schweinehaut aufgetragen wurden. Vanillinhaltige Produkte inaktivierten das Virus innerhalb von 5 Minuten vollständig. Im Gegensatz dazu zeigte Benzalkoniumchlorid keine Veränderungen in der Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze des Virustiters, selbst wenn natürliche Substanzen hinzugefügt wurden. In früheren Berichten [59] und [60] wurde erwähnt, dass Benzalkoniumchlorid im Vergleich zu alkoholbasierten Mitteln eine geringere Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2 zeigte und im Vergleich zu anderen Desinfektionsmitteln in Gegenwart organischer Stoffe empfindlicher reagierte. Die vorliegende Studie zeigte jedoch eine ausreichende antivirale Wirkung dieses Desinfektionsmittels, da die Virusreduktion in Suspension über 4 log lag, was mit anderen Berichten übereinstimmt [61, 62]. Daher kann Benzalkoniumchlorid auch als wirksames Desinfektionsmittel gegen SARS-CoV-2 angesehen werden.

Antivirale Filme, die eine Möglichkeit darstellen, die Ausbreitung von SARS-CoV-2 über die Hände zu verhindern, wurden durch Mischen von PLA und natürlichen Substanzen hergestellt. Die FTIR-Analyse bestätigte die Konjugation von Naturstoffen und PLA. Vanillin und Kaffeesäure ließen sich problemlos mit den PLA-Filmen koppeln und zeigten während der FTIR-Analyse äquivalente funktionelle Verknüpfungen. Dennoch wurden die primären Spektrenzuordnungen sowohl für Vanillin- als auch für Kaffeesäure-beschichtete PLA-Filme als Carboxyl- und Phenolgruppen identifiziert. Frühere Studien [46] und [48] berichteten über ähnliche Ergebnisse. Die FTIR-Analyse zeigte, dass natürliche Substanzen wie Kaffeesäure und Vanillin mit PLA konjugiert sind und eine chemische oder physikalische Konjugation mit diesen natürlichen Substanzen die Eigenschaften der PLA-Folien verbessert. Beispielsweise macht die Zugabe von Kaffeesäure zu PLA die Folie weicher, da erstere als Weichmacher wirkt und möglicherweise auch UV- und Witterungsbeständigkeit verleiht [63, 64]. Vanillin ist in PLA molekular in einem amorphen Zustand dispergiert und erhöht die Geschwindigkeit des biologischen Abbaus von PLA sowie den Modul und die Dehnung [65, 66]. Da der in dieser Studie hergestellte antivirale Film wie in einem früheren Bericht [9] für den Einsatz im wirklichen Leben entwickelt wurde, wurde die Wirksamkeit unter Berücksichtigung zweier Bedingungen bewertet: dem Ausmaß der antiviralen Wirkung während eines kurzen Zeitraums und der antiviralen Aktivität von die natürlichen Stoffe in Gegenwart organischer Stoffe entsprechend der Anzahl der Kontakte. Im Vergleich zum reinen PLA-Film (NP) zeigten der mit Kaffeesäure versetzte PLA-Film (CP) und der mit Vanillin versetzte PLA-Film (VP) signifikante (p < 0,05) logarithmische Virusreduktionen von 1,0 und 1,2 in 1 Stunde. In einer früheren Studie [10] wurde argumentiert, dass Tröpfchen, die Viren enthalten, durch hydrophobe Eigenschaften (z. B. durch Abprallen) entfernt werden können, wodurch die synergistische Wirkung antiviraler Substanzen auf hydrophoben Oberflächen verstärkt wird. Daher könnten die beobachteten antiviralen Wirkungen von CP und VP auf den in dieser Studie vorgeschlagenen Mechanismus zurückzuführen sein [10]. Darüber hinaus kann der 1-Log-Unterschied bei 0 Minuten zwischen NP- und Filmgruppen mit zugesetzten Naturstoffen (CP, VP) das Ergebnis der längeren Trocknung (30 Minuten) sein, die sich wahrscheinlich auf Filme mit Naturstoffen auswirkt.

Um die antivirale Wirksamkeit natürlicher Substanzen anhand der Anzahl der Kontakte mit Schweinehaut zu bewerten, wurden außerdem 10 und 50 Reibungen als Zwischen- und Mehrfachkontakte ausgewiesen, basierend auf einer berichteten Methodik [9]. Der logarithmische Reduktionswert von NP nahm mit zunehmender Zeit und Anzahl der Reibungen ab, was mit einer früheren Studie übereinstimmt [67]. Dennoch wurde ein Unterschied in der Verlustrate festgestellt, der vom Vorhandensein der Flüssigkeit abhängt. Ungefähr 13–16 % des Virus wandern unter feuchten Bedingungen zur Oberfläche des Fomits, während sich unter trockenen Bedingungen nur etwa 3–9 % bewegen. Da außerdem die durch das Reiben erzeugte Reibung die Virusübertragung beeinträchtigen kann, kann die Reibung während der 50 Reibvorgänge zu einer Verringerung des Virustiters führen [68]. Sowohl CP als auch VP zeigten im Laufe der Verarbeitungszeit eine Abnahme des Virustiters. Da jedoch die Anzahl der Reibungen zunahm (50-fach), war die Wirkung auf die Virusreduktion im Vergleich zu einer geringen Kontakthäufigkeit (10-fach) relativ gering. Diese Ergebnisse können durch die Faktoren erklärt werden, die die antimikrobielle Aktivität natürlicher Substanzen beeinflussen [69]. Phenolische Verbindungen zeigen in Gegenwart von stickstoffhaltigen Verbindungen oder Fetten eine eingeschränkte Aktivität und können mit Proteinen Komplexe bilden. Daher zeigten Filme, die 50 Mal auf Schweinehaut gerieben wurden, aufgrund des Vorhandenseins organischer Stoffe in der Schweinehaut eine geringere antivirale Aktivität als Filme, die 10 Mal gerieben wurden. Dennoch erreichte der Virustiter bei CP und VP nach 2-stündiger Behandlung mit Werten von 1,2 log und 1,5 log fast die Nachweisgrenze (1 log TCID50/ml). Auch wenn durch Reibung und Kontakt einige Virusverluste auftraten, zeigten die Filme mit Kaffeesäure und Vanillin eine ausreichende antivirale Aktivität.

Diese Studie untersuchte die antivirale Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln und PLA-Folien mit natürlichen Substanzen (Kaffeesäure und Vanillin) gegen HCoV-229E, einen Ersatz des SARS-CoV-2-Virus. Auf dem Markt verkaufte und hier hergestellte Händedesinfektionsmittel mit natürlichen Substanzen zeigten in Suspension innerhalb von 2 Minuten eine Reduzierung um mehr als 4 log. In dieser Studie wurde auch die Wirksamkeit der vorbereiteten Händedesinfektionsmittel auf mit HCoV-229E kontaminierter Schweinehaut bewertet. Insgesamt hatten die zubereiteten Händedesinfektionsmittel ohne Naturstoffe tendenziell eine etwas geringere antivirale Wirkung als solche mit Naturstoffen. Darüber hinaus erreichte der Virustiter bei letzterem die Nachweisgrenze. Benzalkoniumchlorid zeigte in Suspension und Schweinehaut eine ausreichende antivirale Aktivität; Allerdings gab es nach dem Einbau natürlicher Substanzen keinen Unterschied in der Zeit, die benötigt wurde, um die Nachweisgrenze des Virus zu erreichen. Die FT-IR-Analyse von PLA-Filmen mit Kaffeesäure und Vanillin bestätigte, dass die natürlichen Substanzen und PLA konjugiert waren. Zehnmaliges Reiben mit den Filmen führte zu einer etwas höheren antiviralen Aktivität als 50 Reiben. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie und Literaturberichten empfehlen wir, die auf der Haut vorhandenen organischen Substanzen so weit wie möglich mit Wasser und Seife zu entfernen, bevor Händedesinfektionsmittel und antivirale Filme aufgetragen werden. Darüber hinaus ist weitere Forschung erforderlich, da verschiedene Mutationen und Stämme die Lebensfähigkeit von SARS-CoV-2 auf Haut und Keimen sowie seine Resistenz gegenüber Ethanol erhöht haben. Darüber hinaus sollten neue Alternativen zur Infektionsprävention durch SARS-CoV-2 die synergistische Wirkung von Desinfektionsmitteln mit sekundären Pflanzenstoffen oder anderen antiviralen Substanzen nutzen.

Unzutreffend. Alle relevanten Daten sind im Papier enthalten.

Coronavirus Krankheit 2019

Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2

Menscheninfizierendes Coronavirus 229E

Polymilchsäure

Abgeschwächte Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopieanalyse

Zytopathische Wirkung

Ordentliche PLA-Folie

Mit Kaffeesäure versetzter PLA-Film

Mit Vanillin versetzter PLA-Film

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Diese Forschung wurde durch die Chung-Ang University Research Grants im Jahr 2021 und die Chung-Ang University Research Scholarship Grants im Jahr 2022 unterstützt.

Diese Forschung wurde durch Forschungsstipendien der Chung-Ang-Universität im Jahr 2021 und durch das Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit im Jahr 2022 unterstützt (Förderungsnummer 21153MFDS605).

Seok-Woo Hyun und Sangha Han sind die Co-Erstautoren dieser Forschung.

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und -technologie, Advanced Food Safety Research Group, Chung-Ang-Universität, Anseong-si, Gyeonggi-do, 17546, Republik Korea

Seok-Woo Hyun, Sangha Han, Jeong Won Son, Min Su Song, Dan Ah Kim und Sang-Do Ha

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Hyun – Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Validierung, Verfassen des Originalentwurfs. Han – Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Verfassen des Originalentwurfs. Sohn – Datenkuration, formale Analyse, Visualisierung. Kim – Datenkuration, Untersuchung. Song – Datenkuration, Untersuchung. Ha - Projektverwaltung, Überwachung, Finanzierung.

Korrespondenz mit Sang-Do Ha.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hyun, SW., Han, S., Son, JW et al. Entwicklung und Wirksamkeitsbewertung von Händedesinfektionsmitteln und Polymilchsäurefilmen mit Kaffeesäure und Vanillin für verbesserte antivirale Eigenschaften gegen HCoV-229E. Virol J 20, 194 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02159-z

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Eingegangen: 30. April 2023

Angenommen: 14. August 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02159-z

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