Entwicklung von nicht

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11791 (2023) Diesen Artikel zitieren

163 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

In dieser Studie wurde die nicht elektrisch kontrollierte SalivaDirect-Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (NEC-SD-LAMP) entwickelt, die Infektionen durch die Verstärkung der viralen DNA-Expression im Speichel ohne den Einsatz elektrischer Steuerungssysteme erkennen kann. Bei dieser Methode wurde lediglich durch Zugabe von Wasser in das Gerät virale DNA mit SalivaDirect aus dem Speichel extrahiert, die extrahierte DNA wurde mittels schleifenvermittelter isothermer Amplifikation (LAMP) amplifiziert und die Ergebnisse wurden visuell bestätigt. Schmelzende Palmitinsäure hielt die optimale Temperatur für die LAMP-Reaktion aufrecht, da die Temperatur der Palmitinsäure bei 62,9 °C, ihrem Schmelzpunkt, gehalten wird. Durch die Ausnutzung der Nähe des Schmelzpunkts zur optimalen Temperatur für LAMP kann LAMP ohne Strom betrieben werden. Mit dieser Methode konnten wir mehrere Viren im Speichel nachweisen. NEC-SD-LAMP konnte drei Arten viraler DNA klar unterscheiden, was auf die hohe Spezifität dieser Reaktion hinweist. Darüber hinaus lag die Nachweisgrenze der Viruskonzentration des Geräts bei 2 Kopien pro µL, was darauf hindeutet, dass es möglich ist, DNA-Virusinfektionen im Speichel bereits vor dem Ausbruch einer Virusinfektion nachzuweisen.

Infektionskrankheiten sind die Haupttodesursache in Entwicklungsländern1,2. Ein Grund dafür ist der Mangel an Diagnosetechniken für Infektionserreger. Eine schwerwiegendere Ursache ist der schwierige Zugang zu geeigneten medizinischen Einrichtungen3. Dies verringert die Möglichkeiten für Tests, die für die Diagnose viraler Infektionen wichtig sind. Die frühzeitige Erkennung und Behandlung von Virusinfektionen ist für eine vollständige Heilung und die Verhinderung ihrer Ausbreitung von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus sind in vielen nicht elektrifizierten tropischen Gebieten Infektionskrankheiten wie vernachlässigte Tropenkrankheiten weit verbreitet, sodass es unmöglich ist, herkömmliche Testgeräte einzurichten, die eine elektrische Steuerung erfordern. Daher sind Diagnosetechniken wichtig, die weder eine elektrische Infrastruktur noch eine stabile Spannung erfordern4. Um Entwicklungsländer mit Testtechnologie zu versorgen, ist es daher wichtig, Methoden zu etablieren, die die folgenden drei Kriterien erfüllen: (1) der gesamte Prozess vom Testen bis zur Bestätigung der Ergebnisse kann ohne den Einsatz elektrischer Steuerungssysteme durchgeführt werden, (2) genaue Erkennung von Infektionskrankheiten in einem frühen Stadium und (3) Benutzerfreundlichkeit und Tragbarkeit, die Tests überall ermöglichen, beispielsweise in Wohngebieten oder im Freien, in tropischen oder kalten Regionen (Point-of-Care-Tests [POCT])5.

Zur Durchführung von Tests auf Infektionskrankheiten in nicht elektrifizierten Umgebungen können verschiedene Geräte oder Methoden verwendet werden. Erstens gibt es Infektionstestkits, die auf Antigen-Antikörper-Reaktionen basieren, wie zum Beispiel die Immunchromatographie6,7. Durch das Hinzufügen von Proben zum Kit kann schnell ein Diagnosetest für Infektionskrankheiten durchgeführt und die Ergebnisse visuell oder mit einem Smartphone beobachtet werden. Obwohl mit diesen Geräten problemlos Tests durchgeführt werden können, ist die Erkennung von Infektionen im Frühstadium einer Krankheit aufgrund der von diesen Geräten verwendeten Proteinnachweismethoden schwierig. Nukleinsäuren können durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) effizient amplifiziert werden und sind wirksam bei der Früherkennung von Infektionen.

LAMP ist eine isotherme Genamplifikationsmethode, bei der die Ergebnisse visuell beobachtet werden können8,9,10. Bei dieser Methode wird das Zielgen verstärkt und nachgewiesen, indem die Probe auf eine konstante Temperatur von 60–65 °C erhitzt wird. LAMP verwendet während der Amplifikation vier oder sechs Primer, was eine hohe Spezifität für das Zielgen aufweist. Wenn das Zielgen durch LAMP amplifiziert wird, werden Pyrophosphat-Ionen produziert. Die Pyrophosphationen fangen die Manganionen ein, die im Calcein-Mangan-Ionenkomplex in der LAMP-Probe enthalten sind, wodurch das Calcein luminesziert wird. Dadurch kann das Vorhandensein oder Fehlen des Zielgens visuell anhand der Farbänderung der Probe beobachtet werden11. Aus den oben genannten Gründen weist LAMP eine hohe Spezifität und Nachweisempfindlichkeit sowie Echtzeit-PCR und qRT-PCR12,13 auf, die die Goldstandardmethoden für den Virusnachweis sind. LAMP ist im Vergleich zur PCR eine benutzerfreundliche Methode zum Virusnachweis, da die Reaktion mit einfacher Temperaturkontrolle durchgeführt und die Ergebnisse visuell bestätigt werden können.

Um LAMP in einem nicht elektrifizierten Feld durchzuführen, wurden Einweg-Taschenwärmer verwendet14,15,16,17,18,19. Die LAMP-Methode kann einfach durchgeführt werden, indem eine Probe auf Einweg-Taschenwärmer gelegt wird. Die Ergebnisse können visuell bestätigt werden, was eine verbesserte Tragbarkeit zeigt. Die Ausgangstemperatur dieser Methode ist jedoch instabil, da die Reaktion mit der Wärme von Einweg-Taschenwärmern durchgeführt wird, die insbesondere in kalten oder tropischen Regionen erheblich von der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Darüber hinaus wurde die Extraktion des Zielgens aus einer Probe nicht in Betracht gezogen, da möglicherweise andere Extraktionsverfahren erforderlich sind.

In dieser Studie haben wir eine neue praktische Methode namens „Non-Electrically Controlled SalivaDirect LAMP (NEC-SD-LAMP)“ entwickelt, mit der virale Gene aus Speichel extrahiert, die extrahierte virale DNA verstärkt und die Ergebnisse visuell bestätigt werden können, indem nur Wasser hinzugefügt wird . Bei dieser Methode wird mit SalivaDirect virale DNA aus dem Speichel extrahiert und mit LAMP virale Gene verstärkt, sodass eine Virusinfektion mit bloßem Auge bestätigt werden kann. Im SalivaDirect werden virale Proteine ​​im Speichel durch Zugabe von Proteinase K denaturiert und deaktiviert. Gleichzeitig werden die DNase und RNase im Speichel inaktiviert, sodass die viralen Gene in der Probe stabil erhalten bleiben können. Nach der Reaktion wurde die Probe 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren, und die Reaktion wurde gestoppt und virale DNA aus dem Speichel extrahiert.20.

NEC-SD-LAMP verwendet ein exothermes Mittel und Palmitinsäure, um die SalivaDirect- und LAMP-Reaktionen in einem Reaktionsgerät mit einem isolierten Behälter durchzuführen. Da die Reaktion in einem isolierten Behälter durchgeführt wurde, konnte sie ohne Einfluss der umgebenden Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Wenn dem NEC-SD-LAMP-Gerät Wasser hinzugefügt wird, reagiert das exotherme Mittel im Gerät und erwärmt sich auf 95 °C. Dieser Vorgang beendet die SalivaDirect-Reaktion. Die durch das exotherme Mittel erzeugte Wärme wird auch zum Schmelzen von Palmitinsäure genutzt. Während des Übergangs eines Stoffes vom flüssigen zum festen Zustand wird seine Temperatur auf dem Schmelzpunkt des Stoffes gehalten. Mithilfe dieser Eigenschaft wurde die Temperatur der geschmolzenen Palmitinsäure während des Übergangs der Palmitinsäure vom flüssigen zum festen Zustand auf den Schmelzpunkt (62,9 °C) festgelegt. LAMP wird durchgeführt, indem die Nähe des Schmelzpunkts der Palmitinsäure zur optimalen Temperatur der LAMP-Reaktion ausgenutzt wird.

Basierend auf diesen Prinzipien erreichten wir eine Erwärmung auf etwa 95 °C für mehr als 5 Minuten, was für die Inaktivierung von Proteinase K erforderlich ist, und auf 60–65 °C für mehr als 1 Stunde, was für LAMP erforderlich ist. Dieses Gerät ist klein (20 × 16 × 14 cm) und kann für weniger als 20 USD hergestellt werden. Alle Komponenten mit Ausnahme des exothermen Mittels und des Probenröhrchens, mit denen die Probe in Kontakt kommt, können wiederverwendet werden. Somit ist dieses Gerät kostengünstig und tragbar und kann als POCT in Entwicklungsländern, einschließlich kalten oder tropischen Regionen, eingesetzt werden. Als wir dieses Gerät zum Nachweis von Adenovirus-DNA im Speichel verwendeten, stellten wir eine Viruskonzentration von nur 2 Kopien pro µL fest. Darüber hinaus konnten wir 3 Arten viraler DNAs spezifisch nachweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit diesem Gerät eine frühzeitige Diagnose von Infektionskrankheiten möglich ist.

Abbildung 1a zeigt das hergestellte NEC-SD-LAMP-Gerät. Das Gerät bestand aus einem Ständer, auf dem ein PCR-Röhrchen mit Reagenzien platziert wurde, wenn SalivaDirect durchgeführt wurde, einem exothermen Mittel, einem Polypropylen (PP)-Behälter mit Palmitinsäure, einem vakuumisolierten (VI) Behälter, der während der LAMP verwendet wurde, und einem Rahmen um die Position dieser Komponenten zu bestimmen, und einen Behälter aus Polystyrol (PS) zur Aufnahme aller dieser Komponenten. Ständer und Rahmen wurden mit einem 3D-Drucker hergestellt. Der Ständer enthielt mehrere Löcher für die Platzierung von PCR-Röhrchen, was die gleichzeitige Reaktion mehrerer Proben ermöglichte (Abb. 1b). Der Ständer ist abnehmbar und durch die Verwendung anderer Ständer können wir die Anzahl der Proben in einem Experiment ändern oder Experimente an Röhrchen mit anderen Volumina durchführen. Die exothermen Mittel bestanden aus CaO und Al. Der PP-Behälter bestand aus einer 200 µm dicken PP-Folie und wurde bei der Durchführung der LAMP-Phase in den VI-Behälter eingesetzt (Abb. 1c). Der PS-Behälter wurde durch die Kombination von 2,0 cm dicken Polystyrolplatten gebildet. Der Deckel des PS-Behälters hat ein Loch von 1,0 cm Durchmesser, das dazu dient, den beim SalivaDirect entstehenden Wasserstoff und Wasserdampf nach außen aus dem Behälter abzugeben. Bei der Durchführung der SalivaDirect-Reaktion wurde der PS-Behälter verschlossen und mit einem Band gesichert, und ein 2,0 mm dicker Chloropren-Gummistopfen wurde zwischen Deckel und Behälter angebracht, um den Behälter abzudichten.

Das entwickelte NEC-SD-LAMP-Gerät. (a) Alle Komponenten des NEC-SD-LAMP-Geräts. (b) Stehen Sie für den SalivaDirect. In dieser Komponente befinden sich mehrere Löcher, in die die PCR-Röhrchen eingesetzt werden können. (c) Behälter aus Polypropylen (PP). In diesem Behälter sind die Ständer für das PCR-Röhrchen und die Palmitinsäure montiert.

Abbildung 2 zeigt den Reaktionsprozess im entwickelten Gerät. Während der SalivaDirect-Reaktion wurden der Ständer, das exotherme Mittel sowie die PP- und VI-Behälter (ohne Deckel) in einen PS-Behälter gestellt (Abb. 2a). Zunächst wurde Proteinase K zu einer Speichelprobe in einem PCR-Röhrchen gegeben, das dann auf den Ständer für SalivaDirect gestellt wurde. Nach der Reaktion wurde Milli-Q-Wasser in den PS-Behälter gegeben und der Deckel des PS-Behälters geschlossen, wodurch die folgenden Reaktionen zwischen Milli-Q-Wasser und dem exothermen Mittel ausgelöst wurden:

Mechanismus des NEC-SD-LAMP-Geräts. Diese Abbildungen wurden mit PTC Creo Parametric Version erstellt. 8.0.4.0. (https://www.ptc.com/ja/products/creo/parametric). (a) Funktionsweise des SalivaDirect-Tests. Bei dieser Methode wird die exotherme Reaktion zwischen Milli-Q-Wasser und einem exothermen Mittel durchgeführt, um SalivaDirect durch die Inaktivierung von Proteinase K zu stoppen. Bei diesem Prozess wird Palmitinsäure im PP-Behälter aufgelöst und das Innere des vakuumisolierten (VI) Behälters erhitzt. Container werden ebenfalls durchgeführt. (b) Durchführung des LAMP-Assays. Während des LAMP-Vorgangs wird der PP-Behälter in den VI-Behälter gestellt und das PCR-Röhrchen mit der LAMP-Probe wird auf den Ständer des PP-Behälters gestellt. Die Reaktion wird durch die Anwendung der Übergangswärme der Palmitinsäure beim Übergang vom flüssigen in den festen Zustand durchgeführt.

Die durch diese Reaktion erzeugte Wärme wurde verwendet, um die SalivaDirect-Inaktivierung durch Proteinase K zu stoppen, die Palmitinsäure im PP-Behälter zu schmelzen und das Innere des VI-Behälters zu erwärmen.

LAMP wurde nach dem SalivaDirect durchgeführt. Für die LAMP wurde der PP-Behälter in den VI-Behälter gestellt (Abb. 2b). Die Post-SalivaDirect-Probe wurde dann dem LAMP-Reagenz in einem PCR-Röhrchen zugesetzt und auf einem Ständer im PP-Behälter platziert. Der Deckel des VI-Behälters wurde geschlossen, und der LAMP-Vorgang wurde fortgesetzt. Die Temperatur im PP-Behälter kann bei 62,9 °C, dem Schmelzpunkt der Palmitinsäure, gehalten werden, bis die gesamte Palmitinsäure im PP-Behälter von flüssig in fest übergeht. Da die Reaktion in einem VI-Behälter durchgeführt wird, ist es möglich, die Temperatur der Palmitinsäure aufrechtzuerhalten und eine gleichmäßige Reaktion unabhängig von der Umgebungstemperatur zu erreichen. Nach der Reaktion kann die verfestigte Palmitinsäure wiederverwendet werden, indem der PP-Behälter aus dem VI-Behälter entnommen und erneut erhitzt wird. Diese Doppelbehälterstruktur ermöglicht eine wiederholte Verwendung, ohne dass Gerätekomponenten außer dem exothermen Mittel ausgetauscht werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von Virusinfektionen ohne den Einsatz elektrischer Kontrollsysteme.

Abbildung 3a zeigt die Temperaturänderung im PS-Behälter während der exothermen Reaktion. 150 ml Milli-Q-Wasser wurden in den PS-Behälter gegeben, wobei sich das exotherme Mittel am Boden befand. Die Temperatur zu jedem Zeitpunkt wurde anhand des Widerstands eines Thermistors berechnet, der an der Seite des PS-Behälters angebracht war. Wie in Abb. 3a dargestellt, könnte diese Reaktion den Behälter länger als 5 Minuten auf 94,8 °C erhitzen. Diese Temperatur und diese Reaktionszeit reichen aus, um Proteinase K zu inaktivieren. Wir haben außerdem bestätigt, dass die gesamte Palmitinsäure im PP-Behälter durch Erhitzen geschmolzen werden konnte.

Bei jedem Heizvorgang ändert sich die Temperatur. Die Diagramme zeigen jeweils die Temperatur im Behälter. (a) Temperaturänderung im PS-Behälter während der exothermen Reaktion. (b) Temperaturänderung der Palmitinsäure im PP-Behälter während der LAMP.

Abbildung 3b zeigt die Temperaturänderung der Palmitinsäure im PP-Behälter. Dieses Experiment verifizierte die Temperaturänderung in geschmolzener Palmitinsäure, nachdem der PP-Behälter nach der exothermen Reaktion in den VI-Behälter gestellt wurde. Die Temperatur zu jedem Zeitpunkt wurde anhand des Widerstands eines Thermistors berechnet, der an der Seite des PP-Behälters angebracht war. Wie in Abb. 3b gezeigt, konnte die Temperatur der Palmitinsäure im PP-Behälter erfolgreich länger als 1 Stunde bei 62,7 °C gehalten werden, was für die Durchführung des LAMP ausreichte.

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse eines Tests zum Nachweis viraler DNA im Speichel mit dem entwickelten Gerät. Abbildung 4a zeigt das PCR-Röhrchen nach NEC-SD-LAMP unter Verwendung von Speichelproben, gemischt mit Adenovirus-DNA. Negative Kontrolle (NC) bezieht sich auf NEC-SD-LAMP, das mit Speichelproben ohne Adenovirus-DNA durchgeführt wurde, Positivkontrolle (PC) bezieht sich auf SalivaDirect und LAMP, die mit Speichelproben durchgeführt wurden, die Adenovirus-DNA aus einem herkömmlichen Thermocycler enthielten, und Probe bezieht sich auf NEC- SD-LAMP wurde unter Verwendung von Speichelproben durchgeführt, die Adenovirus-DNA enthielten. Wie in Abb. 4a gezeigt, ähnelte die Farbänderung der Probenlösung optisch der der PC-Probe. Die Proben konnten unter natürlichem Licht identifiziert werden.

NEC-SD-LAMP-Experiment zum Nachweis viraler DNA. Diese Fotos zeigen die Proben im PCR-Röhrchen nach der Reaktion und wurden unter Bestrahlung mit natürlichem Licht oder Anregungslicht aufgenommen. (a) Funktionsvergleich von NEC-SD-LAMP mit einem herkömmlichen System. „NC“, NEC-SD-LAMP wurde mit Speichelproben ohne Adenovirus-DNA durchgeführt. „PC“-, SalivaDirect- und LAMP-Reaktionen wurden mit Speichelproben, die Adenovirus-DNA enthielten, in einem herkömmlichen Thermocycler durchgeführt. „Probe“, NEC-SD-LAMP, wurde unter Verwendung von Speichelproben durchgeführt, die Adenovirus-DNA enthielten. (b) Überprüfung der Nachweisgrenze von NEC-SD-LAMP. „NC“, NEC-SD-LAMP wurde mit Speichelproben ohne Adenovirus-DNA durchgeführt. (c) Analyse der Fluoreszenzintensität von Proben, die die jeweilige Adenovirus-DNA-Konzentration enthalten, mithilfe der ImageJ-Software. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt und die relative Fluoreszenzintensität jedes Experiments wurde basierend auf der Fluoreszenzintensität der NC-Probe berechnet. Der Mittelwert und die Standardabweichung werden in der Grafik angezeigt. (d) Überprüfung der Spezifität von NEC-SD-LAMP. „NC1“, NEC-SD-LAMP wurde mit Speichelproben ohne Cytomegalievirus-DNA oder Adenovirus Typ 41-DNA durchgeführt. „NC2“, NEC-SD-LAMP wurde unter Verwendung von Speichelproben durchgeführt, die Cytomegalovirus-DNA oder Adenovirus-Typ-41-DNA enthielten, und es wurden adenovirale DNA-spezifische Primer verwendet. „Probe“, NEC-SD-LAMP, wurde unter Verwendung von Speichelproben durchgeführt, die Cytomegalovirus-DNA oder Adenovirus-Typ-41-DNA enthielten, und es wurde jeweils der entsprechende virale DNA-Nachweisprimer verwendet.

Um zu bestätigen, dass die SalivaDirect-Reaktion durch die exotherme Reaktion gestoppt wurde, wurde NEC-SD-LAMP an Proben durchgeführt, in denen Proteinase K nicht inaktiviert war. Eine Genamplifikation durch LAMP-Reaktion wurde selbst in Proben, die Adenovirus-DNA enthielten, nicht beobachtet (siehe Abb. 1). Dieses Ergebnis legt nahe, dass das Enzym im LAMP-Reagenz inaktiviert wird und die LAMP-Reaktion nicht korrekt abläuft, wenn Proteinase K nicht ausreichend inaktiviert wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Proteinase K durch eine exotherme Reaktion ausreichend inaktiviert werden kann.

Der Zusatzfilm zeigt eine Videodemonstration der Verwendung von NEC-SD-LAMP. Wie im Zusatzfilm gezeigt, kann NEC-SD-LAMP zur Extraktion von Genen aus Speichel verwendet werden, und die Ergebnisse können ohne elektrisches Steuerungssystem beobachtet und verifiziert werden.

Das NEC-SD-LAMP-Gerät ist für den Einsatz in verschiedenen Bereichen, einschließlich kalter oder tropischer Regionen, konzipiert. Um zu überprüfen, ob eine stabile Reaktion in tropischen Regionen durchgeführt werden konnte, stellten wir das Gerät in einen Inkubator (50 °C) und führten NEC-SD-LAMP durch. Als Probe diente speichelhaltige Adenovirus-DNA, die in der Inkubatorreaktion bei Raumtemperatur erfolgreich nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 2). Wir führten auch NEC-SD-LAMP in einem Gefrierschrank (–20 °C) durch und konnten Adenovirus-DNA im Speichel nachweisen (siehe Abb. 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass das NEC-SD-LAMP-System selbst in Umgebungen mit hohen oder niedrigen Temperaturen stabile Reaktionen durchführen kann.

Abbildung 4b zeigt die Ergebnisse der Nachweisgrenzenüberprüfung zur Bestimmung der Viruskonzentration mit NEC-SD-LAMP. Das PCR-Röhrchen wird nach dem Ausführen von NEC-SD-LAMP mit Speichelproben gezeigt, die Adenovirus-DNA mit Endkonzentrationen im Bereich von 0 bis 200 Kopien pro µL enthalten. Wie in Abb. 4b gezeigt, zeigten Proben, die mehr als 2 Kopien pro µL Adenovirus-DNA enthielten, eine Änderung der Lösungsfarbe im Vergleich zur NC-Probe (0 Kopien pro µL). Abbildung 4c zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzintensitätsanalyse der Proben, die jede Viruskonzentration enthalten, mithilfe der ImageJ-Software. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt und die relative Fluoreszenzintensität jedes Experiments wurde basierend auf der Fluoreszenzintensität der NC-Probe berechnet. Der Mittelwert jeder Probe wird in der Grafik angezeigt. Fehlerbalken im Diagramm geben die Standardabweichung an. Ein t-Test wurde zwischen den NC-Probengruppen und Proben durchgeführt, die jede Viruskonzentration enthielten. Wie in Abb. 4c gezeigt, wurde ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität in Proben beobachtet, die 2 oder mehr Kopien pro µL Adenovirus-DNA enthielten. Im Gegensatz dazu wurde bei Proben, die 1 Kopie pro µL enthielten, ein leichter Anstieg der Fluoreszenzintensität beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Methode Proben visuell erkannt werden können, die mehr als 2 Kopien viraler DNA pro µL enthalten. Wenn eine Fluoreszenzintensitätsanalyse durchgeführt werden kann, können möglicherweise Viruskonzentrationen von nur 1 Kopie pro µL nachgewiesen werden.

Sup. Abb. 4 zeigt die Ergebnisse der Nachweisgrenze zur Bestimmung der Viruskonzentration, wenn SalivaDirect und LAMP mit einem herkömmlichen Thermocycler durchgeführt wurden. Beim Nachweis von Adenovirus-DNA mit dem herkömmlichen System konnte eine Farbveränderung der Lösung von mehr als 1 Kopie pro µL visuell bestätigt werden. Darüber hinaus konnten unter Anregungslichtbestrahlung mehr als 0,5 Kopien pro µL nachgewiesen werden, was eine etwas höhere Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zur NEC-SD-LAMP zeigt.

Wir haben auch die Möglichkeit getestet, NEC-SD-LAMP in einem großen Probenvolumen unter Verwendung eines 1,5-ml-Röhrchens durchzuführen, wobei wir den Nachweis von Speichelproben mit extrem niedrigen Viruskonzentrationen voraussetzten. Das NEC-SD-LAMP-Gerät kann durch Wechseln des Ständers mit einem 1,5-ml-Röhrchen ausgestattet werden (siehe Abb. 4a,b), sodass wir ein viermal größeres Probenvolumen als ein PCR-Röhrchen verwendeten. Als Ergebnis konnten wir eine Änderung der Lösungsfarbe bis zu einer Viruskonzentration von 0,5 Kopien pro µL bestätigen (siehe Abb. 4c), was darauf hindeutet, dass NEC-SD-LAMP nur mit einer Änderung des Standes durchgeführt werden kann , selbst bei großen Proben, die eine große Wärmemenge zur Durchführung der Reaktion erfordern. Diese Ergebnisse zeigen, dass NEC-SD-LAMP zum Nachweis von Viren im Speichel in sehr geringen Konzentrationen eingesetzt werden könnte.

Abbildung 4d zeigt die Ergebnisse des NEC-SD-LAMP, das mit drei Arten viraler DNA durchgeführt wurde. Es wurden Speichelproben verwendet, die DNA des Adenovirus Typ 41 oder des Cytomegalievirus enthielten. NEC-SD-LAMP wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die für Adenovirus, Adenovirus Typ 41 und Cytomegalievirus spezifisch sind. Wie in Abb. 4d dargestellt, wurden Farbveränderungen der Lösung beobachtet, wenn Speichelproben dieselbe Virusspezies enthielten wie die verwendeten Primer. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NEC-SD-LAMP spezifisch gegen das Zielvirus reagieren kann.

Durch die Kombination von SalivaDirect und LAMP kann NEC-SD-LAMP zum Testen auf Virusinfektionen in Speichelproben ohne Strom verwendet werden. Verifizierungsexperimente wurden mit drei Arten viraler DNA durchgeführt. Es ist möglich, in dieser Studie nicht verwendete virale DNA-Sequenzen nachzuweisen, indem die entsprechenden Primersequenzen genau vorbereitet werden.

Da das NEC-SD-LAMP-System Reaktionen in hochisolierten PS- und VI-Behältern durchführt, wird es nicht von den Umgebungstemperaturen beeinflusst. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Reaktionen bei Umgebungstemperaturen von -20 °C und bis zu 50 °C durchgeführt werden konnten. Bei Tests in tropischen Regionen ist es jedoch notwendig, nicht nur das Gerät, sondern auch Reagenzien mit ins Feld zu nehmen. Herkömmliche Reagenzien sind schwierig zu verwenden, da sie unter –20 °C gelagert werden müssen. Seitdem wurden lyophilisierte Reagenzien entwickelt, die bei Raumtemperatur gelagert werden können21. Darüber hinaus werden diese lyophilisierten Reagenzien bereits in der Praxis eingesetzt (DryADD, Nippon Gene Co., Ltd., Tokio, Japan; https://www.nippongenematerial.com/dry_reagent/LAMP_Master_Mix.html). Durch die Kombination des NEC-SD-LAMP-Systems mit lyophilisierten Reagenzien sind Feldtests in tropischen Regionen möglich.

NEC-SD-LAMP konnte virale Gene bereits in einer Konzentration von nur 2 Kopien pro µL erkennen. In der 1,5-ml-Röhrchenreaktion konnte eine Viruskonzentration von bis zu 0,5 Kopien pro µL nachgewiesen werden. Eine der Ursachen der SARS-CoV-2-Pandemie war die begrenzte Anzahl von Testeinrichtungen, die dazu führte, dass Patienten nicht getestet werden konnten, was zu einer Schwere der Symptome oder einer Ausbreitung der Infektion führte. Das NEC-SD-LAMP-System ist nicht nur hochempfindlich und kann Infektionen bereits im Frühstadium erkennen, sondern ist auch tragbar und kann mit sehr einfachen Handgriffen durchgeführt werden. Damit erfüllt es alle erforderlichen Faktoren für POCT und kann zur Lösung der Ursachen der Pandemie beitragen. Darüber hinaus kann das NEC-SD-LAMP-Gerät zu geringen Kosten hergestellt werden. Nukleinsäureanalysatoren für LAMP können durch die praktische Umsetzung von NEC-SD-LAMP verschiedenen Forschungseinrichtungen und kleinen Labors kostengünstig zur Verfügung gestellt werden. Das NEC-SD-LAMP-System hat das Potenzial, zukünftige Ausbrüche von Infektionskrankheiten zu bewältigen.

Da der Zweck dieser Studie darin bestand, die Funktion von NEC-SD-LAMP zu validieren, wurde nur ein Satz Primer validiert. Wenn eine weitere Validierung der optimalen Primersequenz durchgeführt wird, kann die Empfindlichkeit von NEC-SD-LAMP verbessert werden. Andererseits ergaben die Ergebnisse der Durchführung von SalivaDirect und LAMP an derselben Probe mit einem herkömmlichen Thermocycler mehr als 0,5 Kopien pro µL. Da darüber hinaus berichtet wurde, dass die PCR, der Goldstandard der Methoden zum Nachweis von Viren, beim Nachweis viraler DNA und RNA die gleiche Nachweisempfindlichkeit wie LAMP aufweist16,22, wird es als möglich angesehen, dass die PCR mehr als 0,5 Kopien pro Virus nachweisen kann µL. Daraus lässt sich schließen, dass die Nachweisempfindlichkeit von NEC-SD-LAMP geringer ist als die herkömmlicher Methoden. Dies liegt daran, dass NEC-SD-LAMP im Vergleich zu Thermocyclern über keine präzise Temperaturregelung verfügt. Die erhitzte Palmitinsäure unmittelbar nach der SalivaDirect-Reaktion kann die Temperatur der Lösung auf über 65 °C ansteigen lassen. In solchen Fällen überschreitet die Temperatur die optimale Reaktionstemperatur für die LAMP, was die Durchführung einer genauen Reaktion erschwert. Für optimalere Reaktionen muss geklärt werden, wann die optimale Temperatur für jede Reaktion erreicht wird, indem beispielsweise eine temperaturempfindliche Versiegelung am Gerät angebracht wird16.

Die Ergebnisse von NEC-SD-LAMP zeigten, dass der Virusnachweis viel empfindlicher war, wenn die Bild-J-Analyse unter Bestrahlung mit Anregungslicht durchgeführt wurde. Dies deutet darauf hin, dass NEC-SD-LAMP durch den Einsatz eines zusätzlichen Analysesystems die Empfindlichkeit verbessern kann. Wir entwickeln derzeit das NEC-SD-LAMP-Mikrogerät, das das NEC-SD-LAMP-System mit unserem zuvor entwickelten LAMP-Mikrogerät23 kombiniert. Durch die Entwicklung des NEC-SD-LAMP-Mikrogeräts mit einem direkten Verbindungssystem zu Smartphones und einer Anwendung zur Beobachtung der Probenfluoreszenzintensität, die bei der Entwicklung des LAMP-Mikrogeräts entwickelt wurden, werden weitere Kostenreduzierung, Portabilität und höhere Empfindlichkeit möglich.

NEC-SD-LAMP ist ein System, das die Amplifikation der Zielnukleinsäure aus dem Speichel ohne Strom durchführen kann, um Viren in jedem Feldumfeld frühzeitig zu erkennen. Eine Methode zur Durchführung von LAMP in einem einfachen Verfahren und ohne elektrische Steuerung ist die Verwendung einer chemo-exothermen Reaktion mit einem Taschenwärmer14,15,16,17,18,19. Hierbei handelt es sich um kostengünstige, einfach zu bedienende POCT-Geräte, die die Durchführung der LAMP-Methode durch Platzierung der Probe auf dem Wärmer ermöglichen. Viele von ihnen weisen jedoch eine geringe Nachweisempfindlichkeit auf. Ein Grund dafür ist, dass chemo-exotherme Reaktionen temperaturinstabil sind. In vielen Veröffentlichungen wird die Validierung von Temperaturänderungen pro Zeiteinheit nicht beschrieben oder bereitgestellt. Da in einigen Fällen jedoch der Nachweis sehr geringer Viruskonzentrationen möglich ist16, ist eine frühzeitige Testung möglich, wenn optimale Bedingungen, wie etwa der Anteil der Komponenten im Wärmer und die Umgebungstemperatur, geschaffen werden können. Allerdings wurde die Reaktion im Taschenwärmer nur bei Raumtemperatur verifiziert und es hat sich auch gezeigt, dass eine genaue Reaktion in einer Umgebung mit niedriger Temperatur nicht durchgeführt werden kann15. Obwohl Verbesserungen sichtbar sind, wenn Reaktionen in isolierten Behältern durchgeführt werden, gibt es keine Beispiele für erfolgreiche LAMP-Methoden bei Umgebungstemperaturen unter 4 °C. NEC-SD-LAMP detektierte Nukleinsäuren in einem breiten Umgebungsbereich von –20 bis 50 °C (siehe Abb. 2 und 3). Es wird erwartet, dass die Fähigkeit, Nukleinsäureamplifikation in diesem Temperaturbereich durchzuführen, Nukleinsäureamplifikationstechnologie in fast allen Regionen der Welt bereitstellen wird. Darüber hinaus macht die Möglichkeit, die Extraktion viraler DNA durchzuführen, was mit LAMP unter Verwendung von Taschenwärmern nicht möglich ist, das NEC-SD-LAMP zu einem effektiven POCT-System.

Diese Studie zeigte die Möglichkeit eines spezifischen Virusnachweises im Frühstadium der Infektion ohne den Einsatz von Elektrizität. Da die SalivaDirect-Methode ursprünglich für den SARS-CoV-2-Nachweis entwickelt wurde, sollte NEC-SD-LAMP mithilfe von RNA-Viren validiert werden. Der RNA-Abbau erfolgt, wenn die RNA längere Zeit auf hohe Temperaturen erhitzt wird; In solchen Fällen kann keine genaue Erkennung durchgeführt werden. Daher haben wir nur Validierungsexperimente mit DNA-Viren durchgeführt, nicht mit RNA-Viren. Um RNA-Viren mit NEC-SD-LAMP genau nachzuweisen, sollte die Menge an exothermem Mittel und Wasser, die in der exothermen Reaktion verwendet wird, genauer untersucht werden, um die Heiztemperatur und -zeit zu optimieren. Alle Experimente in dieser Studie wurden mit RT-LAMP-Reagenzien durchgeführt und das gleiche Protokoll kann sowohl für RNA-Viren als auch für DNA-Viren verwendet werden. Sobald die optimalen Bedingungen für den RNA-Nachweis untersucht wurden, kann NEC-SD-LAMP für RNA-Viren eingesetzt werden.

Um die Spezifität und Empfindlichkeit von NEC-SD-LAMP genau zu bewerten, ist es notwendig, eine große Anzahl von Grenznachweiskonzentrationen für eine große Anzahl von Virusarten durchzuführen oder Validierungsexperimente mit Speichel durchzuführen, der mit verschiedenen Virusarten gemischt ist vom Ziel-DNA-Virus unterscheidet. Darüber hinaus sind die Spezifität und Empfindlichkeit gegenüber tatsächlichen Viren unklar, da keine Bewertungstests mit tatsächlichen Speichelproben von Patienten durchgeführt wurden. Da der Zweck dieser Studie darin bestand, die Generkennungsfähigkeit von NEC-SD-LAMP nachzuweisen, konnten wir diese Tests nicht verifizieren. Zukünftig planen wir, in Zusammenarbeit mit Universitätskliniken oder anderen Krankenhauseinrichtungen Untersuchungen zu diesen Punkten durchzuführen und Verifizierungsexperimente mit echten Patientenproben durchzuführen.

Das vorgeschlagene System kann LAMP durchführen, indem es die Tatsache ausnutzt, dass der Schmelzpunkt von Palmitinsäure der optimalen Temperatur für LAMP entspricht. Palmitinsäure ist die reichhaltigste gesättigte Fettsäure im menschlichen Körper24. Daher ist es äußerst biokompatibel und für POCT geeignet und wurde in diesem Gerät verwendet. Andere isotherme Nukleinsäureamplifikationsmethoden umfassen den Smart Amplification Process (SmartAmp), die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und die auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (NASBA)25,26,27,28. Diese Methoden können in diesem System durchgeführt werden, indem Substanzen mit Schmelzpunkten verwendet werden, die der optimalen Temperatur für jede Reaktion ähneln, oder indem Paraffin verwendet wird, das auf einen geeigneten Schmelzpunkt eingestellt ist. Daher könnte dieses System auf verschiedene Arten von Reaktionen angewendet werden. Da jedoch bei exothermen Reaktionen Wasserdampf entsteht, kann es sein, dass die Reaktion nicht genau abläuft, wenn eine wasserlösliche Substanz für die isotherme Verstärkungsreaktion verwendet wird. Daher ist es vorzuziehen, fettlösliche Substanzen zu verwenden.

In der vorliegenden Studie haben wir eine neuartige Methode namens NEC-SD-LAMP entwickelt, um Infektionskrankheiten durch Amplifikation viraler DNA aus Speichel ohne Verwendung eines elektrischen Steuerungssystems zu erkennen. Bei dieser Methode kann die gesamte Reaktion durch Zugabe von Milli-Q-Wasser zum Gerät durchgeführt werden, was in nicht elektrifizierten Umgebungen durchgeführt werden kann, einschließlich der Beobachtung der Ergebnisse. Darüber hinaus handelt es sich um ein kleines Gerät, das die Wiederverwendung seiner Komponenten mit Ausnahme des exothermen Mittels ermöglicht und für weniger als 20 US-Dollar hergestellt werden kann, sodass POCT zu geringen Kosten durchgeführt werden kann. Da die Reaktion in einem isolierten Behälter durchgeführt wird, kann sie in Entwicklungsländern, einschließlich kalten oder tropischen Regionen, durchgeführt werden, wenn lyophilisierte Reagenzien verwendet werden. Dieses Gerät ermöglicht die Bereitstellung von Testtechnologie nicht nur für Entwicklungsländer, sondern auch für Katastrophengebiete, in denen es beispielsweise zu großflächigen Stromausfällen kommt. Wenn dieses Gerät sowohl zum Nachweis von RNA als auch von DNA verwendet werden kann, ist NEC-SD-LAMP eine innovative Methode, die das einfache Testen von Virusinfektionen an jedem Standort weltweit ermöglicht.

Der PS-Behälter wurde durch die Kombination von 2,0 cm dicken Polystyrolplatten hergestellt. Im Deckel wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 1,0 cm erzeugt, um den erzeugten Wasserdampf und Wasserstoff aus dem Behälter zu leiten. Ein 2,0 mm dickes Stück Chloroprenkautschuk wurde zwischen der Oberseite des Behälters und dem Deckel platziert und sorgte so für eine Abdichtung zwischen Deckel und Behälter. Zur Fixierung des Deckels am Behälter wurden zwei Bänder um den PS-Behälter gelegt.

Der Ständer und der Rahmen wurden mit einem Mojo 3D-Drucker (Stratasys, Rehovot, Israel) mit einem ABS-Harz (Mojo P430 QuickPack Print Engine, Stratasys) hergestellt.

Der PP-Behälter wurde aus einer 200 µm dicken PP-Folie hergestellt. Der Ständer und 80 g Palmitinsäure (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) wurden in den Behälter gegeben, und zur einfacheren Bedienung wurde ein Griff aus PP-Folie oben auf dem PP-Behälter angebracht. Palmitinsäure (C16H32O2) ist eine Art gesättigte Fettsäure mit einem Schmelzpunkt von 62,9 °C.

Ein im Handel erhältliches exothermes Mittel (Morians Heat Pack Größe L; Morian Heat Pack Co. Ltd., Irima City, Japan; http://www.morians.co.jp/morians/structure.html) und ein VI-Behälter (SR250; ASVEL, Yamatokoriyama-shi, Japan) wurden ebenfalls als Komponenten für das Gerät verwendet. Die Hauptbestandteile des exothermen Mittels bestanden aus Calciumoxid und Aluminium, und in diesem Experiment wurden 45 g verwendet.

Temperaturmessungen während der exothermen Reaktion und der LAMP-Reaktion durch Palmitinsäure wurden unter Verwendung eines zuvor entwickelten Temperaturkontrollsystems29 durchgeführt. Jede Temperatur im System wurde bestimmt, indem der Widerstand eines Thermistors (104 JT; SEMITEC, Tokio, Japan) bei 50 Hz gemessen und Berechnungen auf einem Laptop durchgeführt wurden. Der Widerstand des Thermistors wurde über eine analoge I/O-PC-Karte (ADA16-8/2(CB)L; CONTEC Co., Ltd., Osaka, Japan) in einen Laptop eingegeben und das Temperaturberechnungsprogramm wurde mit LabVIEW erstellt Version 8.2 (NI, Austin, TX, USA). Während der exothermen Reaktion wurde ein Thermistor an der Seite des PS-Behälters angebracht. Während der LAMP-Reaktion wurde der Thermistor nach der Lagerung im VI-Behälter an der Seite des PP-Behälters platziert, um den Thermistor in Kontakt mit der geschmolzenen Palmitinsäure zu bringen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen der gemessenen Temperaturen von 3–13 bis 3–63 Minuten nach Beginn der Messungen während der exothermen Reaktion und der LAMP-Reaktion wurden berechnet.

Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Funktionalität des NEC-SD-LAMP-Systems zu überprüfen. Alle Speichelproben wurden vom Erstautor hergestellt, indem er seinen Speichel nahm und ihn mit der Adenovirus-DNA vermischte. Die gesamte in diesem Experiment verwendete virale DNA wurde von Vircell SL gekauft. Bei diesem Produkt handelt es sich um gefriergetrocknete DNA, die aus Adenoviren isoliert und extrahiert wurde. 50 µL Speichel wurden mit AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL (MBC001; Vircell SL, Grenada, Spanien) bis zu einer Endkonzentration von 100 Kopien pro µL gemischt und in ein PCR-Röhrchen gegeben. Die SalivaDirect-Reaktion wurde durchgeführt, indem MagMAX™ Viral/Pathogen Proteinase K (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit einer Speichelprobe auf eine Endkonzentration von 50 µg pro µL gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Nach der Reaktion wurden 30 µL Mineralöl (M-5904; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zugegeben, um eine Verdunstung der Probe zu verhindern, und das PCR-Röhrchen wurde auf einen Ständer gestellt. In den PS-Behälter wurden ein exothermes Mittel, ein VI-Behälter ohne Deckel, ein PP-Behälter und ein Ständer mit einem PCR-Röhrchen gestellt. 150 ml Milli-Q-Wasser wurden hinzugefügt, um mit dem exothermen Mittel zu reagieren und das Innere des PS-Behälters 5 Minuten lang auf etwa 95 °C zu erhitzen, um Proteinase K zu inaktivieren. Es wurde bestätigt, dass die gesamte Palmitinsäure im PP-Behälter geschmolzen war. Der PP-Behälter wurde in einen VI-Behälter gestellt.

LAMP-Reagenzien wurden durch Mischen einer 2-fach-Reaktionsmischung, einer Enzymmischung, destilliertem Wasser, eines Fluoreszenznachweisreagenzes (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japan) und sechs Primern (FI, BI, F3, B3, Loop F, und Loop B; 001–00890; LAMP Primer Design and Synthesis Service; Nippon Gene, Tokio, Japan), gemäß dem RT-LAMP-Kit-Protokoll (Eiken Chemical Co., Ltd.). Tabelle 1 zeigt die Primersequenzen, die zum Nachweis von Adenovirus-DNA verwendet werden. Die Sequenzen dieser Primer wurden von LAMP Primer Design and Synthesis Service (Nippon Gene, Tokio, Japan) entworfen und synthetisiert. In dieser Studie wurde für jede Virusart ein Satz Primersequenzen validiert. Die Endkonzentration jedes Primers wurde auf 2 µM (PI- und BI-Primer), 0,25 µM (F3- und B3-Primer) oder 1 µM (Loop-F- und Loop-B-Primer) eingestellt. 20 µL des vorbereiteten LAMP-Reagenzes und 5 µL der postSalivaDirect-Probe wurden in ein PCR-Röhrchen gegeben (endgültige Adenovirus-DNA-Konzentration: 20 Kopien pro µL). Nach Zugabe von 20 µL Mineralöl zur Verhinderung der Verdunstung wurde das PCR-Röhrchen auf einen Ständer in einem PP-Behälter gestellt. Anschließend wurde LAMP durchgeführt, indem der Deckel des VI-Behälters geschlossen und dieser 1 Stunde lang auf einen Labortisch gestellt wurde. Nach der Reaktion wurde das PCR-Röhrchen vom Ständer entfernt, die Farbe der Lösung unter natürlichem Licht oder Anregungslicht mit einem SmartBlue Transilluminator (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) beobachtet und jede Beobachtung mit einer Kamera (SO) erfasst -03j; Sony Corporation, Tokio, Japan).

Zum Vergleich wurden die folgenden Reaktionen durchgeführt.

Als Negativkontrolle (NC) wurde eine Speichelprobe ohne AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL verwendet, und NEC-SD-LAMP wurde unter Verwendung derselben oben beschriebenen Reaktion durchgeführt.

Als Positivkontrolle (PC) wurde eine Speichelprobe mit der gleichen Konzentration an AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL vorbereitet und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um die SalivaDirect-Reaktion zu stoppen, und 1 Stunde lang auf 63 °C für die LAMP-Reaktion unter Verwendung von a T100 Thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Um die Wirkung der Proteinase-K-Inaktivierung zu überprüfen, haben wir eine Probe vorbereitet, die nach der SalivaDirect-Reaktion nicht durch ein exothermes Mittel erhitzt wurde. In dieser Studie wurde LAMP mit Palmitinsäure verwendet. Die Probenmenge und die Konzentration der in jedem Prozess verwendeten Reagenzien waren die gleichen wie oben beschrieben.

Um die Funktionalität des NEC-SD-LAMP-Geräts in tropischen Regionen zu überprüfen, wurde es in einem auf 50 °C erhitzten Inkubator (EO-450 V; AS ONE Corporation, Osaka, Japan) installiert und NEC-SD-LAMP durchgeführt . Die Probenmenge und die Konzentration der in jedem Prozess verwendeten Reagenzien waren die gleichen wie oben beschrieben.

Um die Funktionalität des NEC-SD-LAMP-Geräts in kalten Regionen zu überprüfen, wurde es in einem auf –20 °C gekühlten Gefrierschrank (SR-D40C; SANYO, Osaka, Japan) installiert und NEC-SD-LAMP durchgeführt. Die Probenmenge und die Konzentration der in jedem Prozess verwendeten Reagenzien waren die gleichen wie oben beschrieben. Unter Berücksichtigung der Auswirkung des Temperaturanstiegs im Gefrierschrank aufgrund der exothermen Reaktion wurde die Reaktion während der LAMP-Reaktionsphase der Palmitinsäure in einem VI-Behälter durchgeführt, der in einem anderen, auf –20 °C gekühlten Gefrierschrank aufgestellt war.

Um die Nachweisgrenze von NEC-SD-LAMP zu überprüfen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.

Alle Speichelproben wurden vom Erstautor hergestellt, indem er seinen Speichel nahm und ihn mit der Adenovirus-DNA vermischte. Die gesamte in diesem Experiment verwendete virale DNA wurde von Vircell SL gekauft. 50 µL Speichel wurden mit AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL auf eine Endkonzentration von 1000 Kopien pro µL gemischt und in ein PCR-Röhrchen gegeben. Das gleiche Verfahren, das im Abschnitt „NEC-SD-LAMP-Verifizierungsexperiment“ beschrieben ist, wurde zur Durchführung der SalivaDirect- und exothermen Reaktionen verwendet.

Die LAMP-Methode mit Palmitinsäureerwärmung wurde nach dem gleichen Verfahren wie im „NEC-SD-LAMP-Verifizierungsexperiment“ durchgeführt, wonach die Farbe der Lösung unter natürlichem Licht oder Anregungslicht auf einem SmartBlue-Transilluminator beobachtet wurde. Für das LAMP wurde die postSalivaDirect-Reaktionsprobe mit Milli-Q-Wasser auf Endkonzentrationen von 1, 2, 10, 20, 100 und 200 Kopien pro µL Adenovirus-DNA verdünnt und jede Beobachtung wurde mit einer Kamera erfasst. Diese Bilder wurden mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health) analysiert.

Als Vergleichsexperiment wurden die folgenden Reaktionen durchgeführt.

Als Negativkontrolle (NC) wurde eine Speichelprobe ohne AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL verwendet, und NEC-SD-LAMP wurde unter Verwendung derselben oben beschriebenen Reaktion durchgeführt.

Um die Grenznachweiskonzentration mit der herkömmlichen Methode zu bestätigen, wurde eine Speichelprobe mit der gleichen Konzentration an AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL vorbereitet und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um die SalivaDirect-Reaktion zu stoppen, und 1 Stunde lang auf 63 °C für die LAMP-Reaktion Reaktion mit einem T100 Thermal Cycler.

Als großvolumiges NEC-SD-LAMP-Experiment wurde NEC-SD-LAMP in einem 1,5-ml-Röhrchen durchgeführt. Die Reagenzkonzentration war die gleiche wie oben beschrieben, und die Reaktion wurde mit einer Vervierfachung des Gesamtlösungsvolumens durchgeführt. Die Endkonzentration der Adenovirus-DNA wurde auf 0 (NC), 0,5 und 1 Kopie pro µL eingestellt.

Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Spezifität von NEC-SD-LAMP zu überprüfen. Alle Speichelproben wurden vom Erstautor hergestellt, indem er seinen Speichel mit der Adenovirus-Typ-41- oder Cytomegalovirus-DNA vermischte. Die gesamte in diesem Experiment verwendete virale DNA wurde von Vircell SL gekauft. Bei diesem Produkt handelt es sich um gefriergetrocknete DNA, die aus Adenovirus Typ 41 oder Cytomegalovirus isoliert und extrahiert wurde. 50 µL Speichel wurden mit AMPLIRUN ADENOVIRUS 41 DNA CONTROL (MBC114, Vircell) oder AMPLIRUN CYTOMEGALOVIRUS DNA CONTROL (MBC016, Vircell) bis zu einer Endkonzentration von 100 Kopien pro µL gemischt und in ein PCR-Röhrchen gegeben. Das gleiche Verfahren, das im Abschnitt „NEC-SD-LAMP-Verifizierungsexperiment“ beschrieben ist, wurde zur Durchführung der SalivaDirect- und exothermen Reaktionen verwendet. Die LAMP-Methode mit Palmitinsäureerwärmung wurde nach dem gleichen Verfahren wie im „NEC-SD-LAMP-Verifizierungsexperiment“ durchgeführt, wonach die Farbe der Lösung unter natürlichem Licht oder Anregungslicht auf einem SmartBlue-Transilluminator beobachtet wurde. Tabelle 1 zeigt die in diesem Experiment verwendeten Primersequenzen. Die Sequenzen dieser Primer wurden von LAMP Primer Design and Synthesis Service (Nippon Gene, Tokio, Japan) entworfen und synthetisiert.

Als Vergleichsexperiment wurden die folgenden Reaktionen durchgeführt.

Als Negativkontrolle 1 (NC1) wurde eine Speichelprobe ohne virale DNA verwendet und NEC-SD-LAMP wurde mit der gleichen Reaktion wie oben beschrieben durchgeführt.

Als Negativkontrolle 2 (NC2) wurde eine Speichelprobe verwendet, die jede virale DNA enthielt, und NEC-SD-LAMP wurde unter Verwendung eines adenoviralen DNA-Nachweisprimers durchgeführt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

Yager, P. et al. Mikrofluidische Diagnosetechnologien für die globale öffentliche Gesundheit. Natur 442, 412–418 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Urdea, M. et al. Anforderungen an High-Impact-Diagnostika in Entwicklungsländern. Nature 444 (Beilage 1), 73–79 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Yager, P., Domingo, GJ & Gerdes, J. Point-of-Care-Diagnostik für die globale Gesundheit. Annu. Rev. Biomed. Ing. 10, 107–144 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Flambard, J., Amirat, Y., Feld, G., Benbouzid, M. & Ruiz, N. Überblick über die Stromstärke von Flüssen und Mündungen. J. Mar. Sci. Ing. 7, 365 (2019).

Artikel Google Scholar

Lee, WG, Kim, YG, Chung, BG, Demirci, U. & Khademhosseini, A. Nano-/Mikrofluidik zur Diagnose von Infektionskrankheiten in Entwicklungsländern. Adv. Drogenlieferung Rev. 62, 449–457 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, Z. et al. Schneller und empfindlicher Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgG mithilfe eines auf Lanthanid-dotierten Nanopartikeln basierenden Lateral-Flow-Immunoassays. Anal. Chem. 92, 7226–7231 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roda, A. et al. Duale optische/Chemilumineszenz-Immunsensoren mit seitlichem Fluss für den schnellen Nachweis von Speichel- und Serum-IgA bei Patienten mit COVID-19-Erkrankung. Biosens. Bioelektron. 172, 112765 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Notomi, T. et al. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation von DNA. Nukleinsäuren Res. 28, E63 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T. & Notomi, T. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer nicht denaturierten Vorlage. Klin. Chem. 47, 1742–1743 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagamine, K., Hase, T. & Notomi, TJMCP Beschleunigte Reaktion durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation unter Verwendung von Schleifenprimern. Mol. Zelle. Sonden 16, 223–229 (2022).

Artikel Google Scholar

Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. & Notomi, T. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) von Gensequenzen und einfacher visueller Nachweis von Produkten. Nat. Protokoll. 3, 877–882 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mackay, IM, Arden, KE & Nitsche, A. Echtzeit-PCR in der Virologie. Nukleinsäuren Res. 30, 1292–1305 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sethuraman, N., Jeremiah, SS & Ryo, A. Interpretation diagnostischer Tests für SARS-CoV-2. JAMA 323, 2249–2251 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y. et al. Point-of-Care-Multiplex-Assays von Nukleinsäuren mittels mikrokapillarbasierter, schleifenvermittelter isothermer Amplifikation. Anal. Chem. 86, 7057–7062 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ben, H. et al. LAMP verwendet einen Einweg-Taschenwärmer zur Milzbranderkennung, eine äußerst mobile und zuverlässige Methode zur Bekämpfung von Bioterrorismus. Jpn. J. Infizieren. Dis. 63, 36–40 (2010).

Artikel Google Scholar

Yun, HB et al. Einfache, schnelle und empfindliche tragbare molekulare Diagnose des SFTS-Virus mittels reverser Transkriptionsschleifen-vermittelter isothermer Amplifikation (RT-LAMP). J. Mikrobiol. Biotechnologie. 28, 1928–1936 (2018).

Artikel Google Scholar

Ben, H. et al. Mobiles und genaues Nachweissystem für eine Infektion mit dem pandemischen Influenza-A-Virus (H1N1) von 2009 mit einer Taschenwärmer-Reverse-Transkriptase-Schleife-vermittelten isothermen Amplifikation. J. Med. Virol. 83, 568–573 (2011).

Artikel Google Scholar

Anthony, A. et al. Nachweis von Mycobacterium ulcerans durch die schleifenvermittelte isotherme Amplifikationsmethode. PLoS Negl. Trop. Dis. 6, e1590 (2012).

Artikel Google Scholar

Kim, D., Kim, SJ, Kim, YK, Kwon, KT & Kim, S. Klinische Bewertung eines innovativen isothermen Verstärkungserkennungssystems für die COVID-19-Diagnose. Anal. Methoden 14, 2578–2585 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vogels, C. et al. SalivaDirect: SARS-CoV-2-Diagnostik ohne RNA-Extraktion. Protokolle.io (2020).

Panno, S. et al. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation: Prinzipien und Anwendungen in der Pflanzenvirologie. Pflanzen (Basel) 9, 461 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kenta, M. et al. Bewertung der SARS-CoV-2-RNA-Quantifizierung durch RT-LAMP im Vergleich zu RT-qPCR. J. Infizieren. Chemother. 27, 1068–1071 (2021).

Artikel Google Scholar

Kimura, Y., Ikeuchi, M., Inoue, Y. & Ikuta, K. Point-of-Care-Testchip zur Erkennung mehrerer Virusinfektionen mithilfe von LAMP. In Conf Proc IEEE 32. Internationale Konferenz über mikroelektromechanische Systeme 83–86 (2019).

Eva, G. et al. Palmöl am Rand. Nutrients 11, 2008. https://doi.org/10.3390/nu11092008 (2019).

Artikel Google Scholar

Piepenburg, O., Williams, CH, Stemple, DL & Armes, NA DNA-Nachweis mithilfe von Rekombinationsproteinen. PLOS Biol. 4, e204 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HE et al. Empfindlicher elektrochemischer Biosensor kombiniert mit isothermer Verstärkung für Point-of-Care-COVID-19-Tests. Biosens. Bioelektron. 182, 113168 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitani, Y. et al. Schnelle SNP-Diagnose mit asymmetrischer isothermer Verstärkung und einer neuen Technologie zur Unterdrückung von Fehlpaarungen. Nat. Methoden 4, 257–262 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sharma, A. et al. COVID-19-Diagnose: Aktuelle und zukünftige Techniken. Int. J. Biol. Makromol. 193, 1835–1844 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimura, Y., Ikeuchi, M., Inoue, Y. & Ikuta, K. 3D-Mikrogeräte, die Probenextraktion und Multiplex-qRT-PCR zur Krebsfrüherkennung mit Bestätigung spezifischer RNAs durchführen. Wissenschaft. Rep. 8, 17480 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von JST, ACT X (Grant Number JPMJAX21K4), Japan und dem Research Center for Biomedical Engineering unterstützt. Dieses Papier wurde vom Nature Research Editing Service herausgegeben.

Abteilung für Präzisions-Biomedizintechnik, Institut für Biomaterialien und Bioingenieurwesen, Medizinische und Zahnmedizinische Universität Tokio, 2-3-10 Kandasurugadai, Chiyoda-ku, Tokio, Japan

Yusuke Kimura und Masashi Ikeuchi

Abteilung für fortgeschrittene Funktionsmaterialforschung, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum Science and Technology (QST), 1233 Watanuki-machi, Takasaki, Gunma, Japan

Yusuke Kimura

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

YK und MI haben die Studie konzipiert. YK führte die Experimente durch und analysierte die Daten. MI trug zur Manuskripterstellung bei und YK schrieb das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Masashi Ikeuchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzungsfilm 1.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kimura, Y., Ikeuchi, M. Entwicklung der nicht elektrisch gesteuerten SalivaDirect LAMP (NEC-SD-LAMP), einer neuen nicht elektrischen Methode zum Testen von Infektionskrankheiten. Sci Rep 13, 11791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38800-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 09. Mai 2023

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38800-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.