Nicht typisierbare Haemophilus influenzae, die durch monoklonale Antikörper, die gegen eine Biofilmmatrixkomponente gerichtet sind, aus der Biofilmresidenz freigesetzt werden, weisen einen anfälligen Phänotyp auf

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12959 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle Biofilme tragen erheblich zur Pathogenese, zum Wiederauftreten und/oder zur Chronizität der meisten bakteriellen Erkrankungen bei, da sie sich deutlich gegen die Clearance wehren. Hier untersuchten wir die Kinetik der erhöhten Empfindlichkeit von nicht typisierbaren Haemophilus influenzae (NTHI), die durch einen monoklonalen Antikörper gegen ein bakterielles DNABII-Protein (α-DNABII) neu aus der Biofilmresidenz freigesetzt (NRel) werden, gegenüber der bevorzugten Abtötung durch ein β-Lactam-Antibiotikum. Dieser Phänotyp wurde innerhalb von 5 Minuten erkannt und hielt etwa 6 Stunden an. Die relative Expression von Genen, die aufgrund ihrer bekannten Beteiligung an der Empfindlichkeit gegenüber einem β-Lactam ausgewählt wurden, zeigte eine vorübergehende hochregulierte Expression von Penicillin-bindenden Proteinen durch α-DNABII NTHI NRel, wohingegen die Expression des β-Lactamase-Vorläufers begrenzt war. Die vorübergehende herunterregulierte Expression von Mediatoren des oxidativen Stresses unterstützte eine ähnlich zeitliche Anfälligkeit für die NADPH-Oxidase-empfindliche intrazelluläre Abtötung durch aktivierte menschliche PMNs. Darüber hinaus stimmte die vorübergehende hochregulierte Expression des Haupt-NTHI-Porins gut mit der beobachteten erhöhten Membranpermeabilität von α-DNABII NTHI NRel überein, eine Eigenschaft, die auch NRel von drei weiteren Pathogenen zeigt. Diese Daten liefern mechanistische Einblicke in den vorübergehenden, aber äußerst anfälligen α-DNABII-NRel-Phänotyp. Dieses verbesserte Verständnis unterstützt die weitere Validierung dieses neuartigen Therapieansatzes, der darauf abzielt, das Wissen über den α-DNABII-NRel-Phänotyp für eine wirksamere Beseitigung widerspenstiger Biofilm-bedingter Krankheiten zu nutzen.

Bakterielle Biofilme tragen wesentlich zur Pathogenese akuter und chronischer Infektionen1 sowie zum Wiederauftreten und der Unfähigkeit einer Behandlung bei vielen Krankheiten bei2. Häufige Krankheiten, bei denen Biofilme eine Schlüsselrolle spielen, sind unter anderem Mittelohrentzündung, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Parodontitis und Mukoviszidose3,4,5. Die kanonische Biofilmtoleranz ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen. Wichtig ist jedoch, dass Bakterien innerhalb eines Biofilms im Hinblick auf die Krankheitsauflösung äußerst resistent sowohl gegen Antibiotika als auch gegen Immuneffektoren des Wirts sind6,7,8. Tatsächlich sind im Biofilm lebende Bakterien im Vergleich zu ihren planktonisch gewachsenen Gegenstücken bis zu 1000-mal resistenter gegen herkömmliche Antibiotika9,10,11. Darüber hinaus sind Infektionen, an denen Biofilme beteiligt sind, kostspielig; Es wird geschätzt, dass die weltweite wirtschaftliche Belastung durch Biofilme im Zusammenhang mit medizinischen und menschlichen Gesundheitskosten im Jahr 2019 etwa 387 Milliarden US-Dollar betrug12.

Um diese häufigen und hochresistenten biofilmbedingten Krankheiten wirksam zu behandeln, sind neue Strategien erforderlich. Viele Labore arbeiten auf solche Ziele hin13,14,15,16,17,18. In diesem Zusammenhang hat unser Labor einen gezielten, auf monoklonalen Antikörpern basierenden Ansatz entwickelt, der im Biofilm lebende Bakterien wirksam aus ihrer schützenden Strukturmatrix freisetzt, sodass sie durch Immuneffektoren des Wirts und/oder herkömmliche Antibiotika leichter abgetötet werden können. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns speziell auf einen allgegenwärtigen Strukturbestandteil der bakteriellen Biofilmmatrix, bakterielle DNA-bindende Proteine, die als DNABII-Familie bekannt sind. Die beiden DNABII-Proteine, Histon-ähnliches Protein (HU) und Integrationswirtsfaktor (IHF), binden an doppelsträngige DNA und biegen diese19,20,21. DNABII-Proteine ​​sind an den Spitzen von Kreuzsträngen extrazellulärer DNA (eDNA) innerhalb der Biofilmmatrix positioniert, wo sie als Dreh- und Angelpunktproteine ​​dienen, die dem gitterartigen eDNA-Gerüst eine entscheidende strukturelle Unterstützung bieten22. Wenn Biofilme, die in vitro von verschiedenen menschlichen Krankheitserregern gebildet werden, mit Antikörpern inkubiert werden, die entweder gegen ein natives DNABII-Protein oder ein synthetisches „Tip-Chimer“-Peptidimmunogen gerichtet sind, haben wir entwickelt, um die immunschützenden DNA-bindenden „Spitzen“ eines DNABII-Proteins nachzuahmen, das induzierte Gleichgewicht Die Verschiebung führt zu einem schnellen Zusammenbruch des Biofilms mit gleichzeitiger Freisetzung biofilmresidenter Bakterien22,23,24,25.

Anti-DNABII-Antikörper haben in drei präklinischen Modellen menschlicher Krankheiten ihr disruptives Potenzial sowie ihre Wirksamkeit bei der Krankheitsbekämpfung gezeigt. Die therapeutische Behandlung mit Anti-DNABII-Antikörpern entfernte aggregierte Pseudomonas aeruginosa-Biofilme aus der Mauslunge24 und löste anhaftende Schleimhautbiofilme auf, die durch Aggregatibacter actinomycetemcomitans in einem Rattenmodell für osteolytische Periimplantitis gebildet wurden26. Darüber hinaus führten antigenbindende Fragmente (z. B. Fabs), die aus dem humanisierten DNABII-Spitzenchimär stammen, bei der Einführung in das Mittelohr von Chinchillas zu einer monoklonal vermittelten Auflösung von Schleimhautbiofilmen in einem Modell einer durch nicht typisierbare Haemophilus influenzae (NTHI) induzierten Mittelohrentzündung27. Aus präventiver Sicht induziert die aktive Immunisierung mit dem Tip-Chimer-Peptid bei der Verwendung als Vakzinogen die Bildung von Antikörpern in situ, die durch NTHI im Mittelohr des Chinchillas gebildete vorhandene Biofilme zerstören und eine schnelle Heilung der Krankheit ermöglichen, ohne dass Antibiotika erforderlich sind25.

Unabhängig von der genauen verwendeten Methode berichten mehrere Labore, dass neu aus dem Biofilm freigesetzte Bakterien einen ausgeprägten, wenn auch vorübergehenden Phänotyp einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber antibiotikavermittelter Abtötung aufweisen18,28,29,30,31,32,33. Ein häufig beobachtetes und überzeugendes Merkmal von Bakterien, die neu aus ihrer Biofilmfestung freigesetzt werden, besteht nicht nur erwartungsgemäß darin, dass sie empfindlicher auf die Abtötung reagieren als solche, die im Biofilm vorkommen, sondern auch, dass diese deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der durch Antibiotika vermittelten Abtötung im Vergleich zu beobachtet wird ihre planktonisch gewachsenen Gegenstücke, wobei letztere bisher als die antibiotikaempfindlichste bakterielle Lebensweise galten23,30,31,34,35,36.

Interessanterweise untersuchten wir die Anfälligkeit von neu freigesetztem NTHI (NRel) aus dem Biofilmaufenthalt für die Abtötung durch zwei Antibiotika, die häufig zur Behandlung von Personen mit NTHI-induzierten Atemwegserkrankungen eingesetzt werden, z. B. Amoxicillin plus Clavulansäure (A/C) oder Trimethoprim plus Sulfamethoxazol (T/S)] waren NRel, die durch ein monoklonales Anti-DNABII-Protein (α-DNABII) induziert wurden, vorzugsweise deutlich empfindlicher gegenüber A/C (und nicht T/S) als ihre planktonischen Gegenstücke36. Darüber hinaus ergab eine vollständige Proteomanalyse, dass α-DNABII NTHI NRel im Vergleich zu planktonisch gewachsenem NTHI in der mittleren Log-Phase ein deutliches proteomisches Expressionsprofil aufwies, wie durch die Hauptkomponentenanalyse belegt36. Darüber hinaus und relevant für die hier vorgestellten neuen Arbeiten zeigte α-DNABII NTHI NRel eine signifikante > 1,5-fache Zunahme oder Abnahme der Häufigkeit von 103 unterschiedlich exprimierten Proteinen im Vergleich zu planktonischem NTHI36.

Hier versuchten wir, die Kinetik des α-DNABII NTHI NRel-Phänotyps mit bevorzugter Empfindlichkeit gegenüber der Abtötung durch ein β-Lactam-Antibiotikum besser zu definieren, insbesondere wie schnell er sich entwickelt und wie lange er anhält. Wir waren auch daran interessiert, sowohl die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die dieser Empfindlichkeit zugrunde liegen könnten, als auch die damit verbundenen biologischen Eigenschaften der α-DNABII-NRel-Population. Zu diesem Zweck verwendeten wir den gut charakterisierten NTHI-Stamm 86-028NP37,38, der ursprünglich aus dem Nasopharynx eines Kindes isoliert wurde, bei dem aufgrund einer chronischen Mittelohrentzündung ein Paukenröhrchen eingeführt werden musste, als Modellorganismus zur weiteren Definition und Charakterisierung des α-DNABII NRel-Phänotyp dieses vorherrschenden Erregers der Atemwege.

Während frühere Arbeiten zeigten, dass NTHI NRel nach 15-minütiger oder 2-stündiger Exposition gegenüber α-DNABII36 eine bevorzugte Abtötung durch ein β-Lactam-Antibiotikum als durch ein Sulfonamid zeigte, versuchten wir hier, die Kinetik dieses Ergebnisses klarer zu definieren. Daher testeten wir nach der Inkubation eines 16-stündigen NTHI-Biofilms mit α-DNABII für 1 m, 5 m, 15 m, 2 h, 4 h oder 6 h die Abtötung von NTHI NRel entweder durch A/C oder T/S ( Abb. 1)39. Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen wurden im Laufe der Zeit erhöht, um das Bakterienwachstum im Kultursystem zum Zeitpunkt der Bakteriensammlung auszugleichen (Tabelle 1), während gleichzeitig die Abtötung von NTHI, das planktonisch in Flüssigkeiten über den Biofilmen wuchs, bei etwa 15–25 % gehalten wurde, um dies zu ermöglichen Nachweis einer erhöhten Empfindlichkeit von NRel. Die Anzahl (KBE/ml) von NTHI, die planktonisch im Medium über dem Biofilm wuchs, oder die von NTHI, die nach dem angegebenen Zeitraum durch α-DNABII aus dem Biofilmaufenthalt freigesetzt wurde, ist in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Das relative Verhältnis der Rückgewinnung von α-DNABII NTHI NRel zu dem derjenigen, die im Medium über dem Biofilm planktonisch wuchsen, lag zwischen 1,3:1 und 2,4:1, ähnlich wie wir zuvor berichtet haben40.

Kinetisches Profil der Antibiotikaempfindlichkeit von α-DNABII NTHI NRel gegenüber A/C oder T/S. Die Konzentrationen der verwendeten Antibiotika wurden vorab festgelegt, um die Abtötung von Bakterien, die planktonisch in den Flüssigkeiten wuchsen, die einen Biofilm in unserem Kultursystem (z. B. „Plank“ im Schlüssel) überlagern, auf etwa 15 bis 25 % zu begrenzen, damit wir sie leicht erkennen können verstärkte Abtötung des α-DNABII NTHI NRel (z. B. „α-DNABII NRel“ im Schlüssel). Innerhalb von 5 m nach der Exposition des Biofilms gegenüber α-DNABII zeigte NTHI NRel eine signifikant stärkere Abtötung durch Klimaanlage als planktonisches NTHI (p ≤ 0,01). Bei 15 m erreichte α-DNABII NTHI NRel den höchsten Grad an deutlich höherer Abtötung durch Klimaanlage im Vergleich zu planktonischem NTHI (p ≤ 0,0001). Die Gesamtanfälligkeit gegenüber Klimaanlagen erreichte ihren Höhepunkt nach 2 Stunden Biofilm-Exposition gegenüber α-DNABII (p ≤ 0,0001) und blieb nach 4 Stunden Biofilm-Exposition gegenüber α-DNABII signifikant erhöht (p ≤ 0,0001). Im Gegensatz dazu blieb die T/S-vermittelte Abtötung von α-DNABII NTHI NRel während des gesamten Testzeitraums bei ~ 25 % oder weniger und war statistisch gesehen nie größer als die Abtötung planktonischer Bakterien durch T/S. Die statistische Signifikanz wurde mittels einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Šidák bestimmt. **p ≤ 0,01; ****p ≤ 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die angezeigten Daten sind repräsentativ für drei separate Tests, die jeweils an unterschiedlichen Tagen durchgeführt wurden, mit 2–3 technischen Wiederholungen pro Test.

Zu jedem getesteten Zeitpunkt überstieg die T/S-vermittelte Abtötung von α-DNABII NTHI NRel nie 25 %, was mit unserem vorherigen Bericht einer minimalen relativen Anfälligkeit gegenüber diesem Antibiotikum bei Tests an α-DNABII NRel, die bei 15 m oder 2h36 wiederhergestellt wurden, übereinstimmt. Die Abtötung von α-DNABII NTHI NRel durch T/S war bei 5 und 15 m am größten, nahm jedoch um 2 Stunden ab und blieb sowohl nach 4 Stunden als auch nach 6 Stunden bei oder unter 20 %. Die Abtötung von α-DNABII NTHI NRel durch T/S war nie signifikant größer als die von planktonischem NTHI durch T/S.

Umgekehrt war die Empfindlichkeit von α-DNABII NTHI NRel gegenüber der Abtötung durch Klimaanlage innerhalb von 5 m deutlich größer als die von planktonischem NTHI (p = 0,003). Diese bevorzugte Empfindlichkeit gegenüber dem β-Lactam-Antibiotikum erreichte innerhalb von NRel ihren Höhepunkt, nachdem der Biofilm 2 Stunden lang α-DNABII ausgesetzt wurde (p = 0,0001), ein Grad an signifikantem Unterschied, der zum 4-Stunden-Zeitpunkt bestehen blieb (p < 0,0001). Nach 6 Stunden unterschied sich die Anfälligkeit von α-DNABII NTHI NRel für die Abtötung durch Klimaanlage nicht von der der planktonischen Abtötung durch Klimaanlage oder T/S.

Angesichts der Tatsache, dass NTHI-NRel, die zum Zeitpunkt von 2 Stunden wiederhergestellt wurden, deutlich empfindlich auf die Abtötung durch Klimaanlagen reagierten, wohingegen diejenigen, die zum Zeitpunkt von 6 Stunden wiederhergestellt wurden, diese spezifische Eigenschaft verloren hatten, konzentrierten wir uns als Nächstes auf die vergleichende Bewertung dieser beiden NRel-Populationen, um zu bestimmen, was könnte zu der festgestellten erhöhten A/C-Empfindlichkeit beitragen.

Es soll damit begonnen werden, die relativen Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber Abtötung durch Klimaanlage zwischen 2 h α-DNABII NTHI NRel („2 h NRel“) und denen, die nach 6 h geborgen wurden („6 h NRel“), zu bestimmen, die diese Eigenschaft nicht mehr aufwiesen Wir haben einen Satz von 15 Primerpaaren erstellt (Ergänzungstabelle S2), die die Empfindlichkeit gegenüber einem β-Lactam-Antibiotikum mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) in Echtzeit spezifisch charakterisieren sollen.

Die erste profilierte Untergruppe besteht aus drei kanonischen Lag-Phase-Genen (fis, deaD und artM), die hier wie in früheren Arbeiten verwendet werden, in denen wir zeigten, dass sich NTHI NRel nach 15 m Biofilm-Exposition gegenüber α-DNABII erholte und beide eine Fülle an ribosomalen Proteinen aufwiesen, die für charakteristisch sind Bakterien in der Lag-Phase und eine signifikant (p ≤ 0,05) größere Transkripthäufigkeit dieser drei Gene im Vergleich zu planktonischem NTHI36,41. Daher haben wir uns nun gefragt, ob sich das 2-Stunden-NRel, das eine bevorzugte Empfindlichkeit gegenüber A/C zeigte, wahrscheinlich immer noch in der Verzögerungsphase befand, zum Zeitpunkt von 6 Stunden jedoch nicht mehr. Diese drei kanonischen Lag-Phase-Gene zeigten tatsächlich eine signifikante, etwa vier- bis achtfach höhere Häufigkeit nach 2 Stunden im Vergleich zu 6 Stunden (Abb. 2). Damit lieferten diese Daten einen weiteren Beweis dafür, dass NTHI NRel nach der Freisetzung aus dem Biofilm durch α-DNABII innerhalb von 15 Minuten und bis mindestens 2 Stunden nach der Freisetzung Bakterien in der Verzögerungsphase zu imitieren schien.

2 h und 6 h α-DNABII NTHI NRel unterschieden sich in der relativen Transkription einer Reihe von Genen, deren Produkte bekanntermaßen an der Empfindlichkeit gegenüber einem β-Lactam-Antibiotikum beteiligt sind. Durch qRT-PCR waren 2-Stunden- und 6-Stunden-α-DNABII-NTHI-NRel durch Analyse von 15 gezielt profilierten Genen transkriptionell unterschiedlich. 11 der 15 profilierten Gene waren im 2-Stunden-α-DNABII-NTHI-NRel im Vergleich zu NRel, der nach 6 Stunden gesammelt wurde, signifikant hochreguliert (> zweifache Änderung), und zwei Gene waren signifikant herunterreguliert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Analyse jedes Gens erfolgte mindestens dreimal an verschiedenen Tagen mit 2–3 technischen Dreifachversuchen pro Test. [Hinweis: MDEP – Multidrug-Efflux-Pumpe].

Als nächstes untersuchten wir die relative Expression von ompP2, das für OMP P2 kodiert, das Hauptporin der Außenmembran von NTHI42,43, da dieses Porin wahrscheinlich am Zugang von A/C in die Bakterienzelle beteiligt ist. Im Vergleich zu 6 h NRel zeigte 2 h NRel eine signifikante, fast zehnfach erhöhte Expression von ompP2. Somit lieferte dieser Befund auch einen möglichen Mechanismus für die beobachtete signifikant stärkere Abtötung von 2-Stunden-NRel durch Klimaanlage, die nach 6 Stunden nicht mehr beobachtet wurde.

Der nächste Satz von drei Genen (z. B. ftsl, dacA und dacB) kodiert bakterielle Penicillin-bindende Proteine ​​(PBPs), die Ziele von β-Lactam-Antibiotika sind44,45,46,47,48. Wir fanden einen signifikanten dreifachen Anstieg der Expression jedes PBP-Gens in 2-Stunden-NRel im Vergleich zu 6-Stunden-NRel, ein Befund, der erneut auf einen möglichen Mechanismus für die beobachtete erhöhte Empfindlichkeit gegenüber A/C schließen lässt, der kurz nach der Freisetzung aus dem Biofilmaufenthalt durch α nachweisbar war -DNABII.

Als nächstes untersuchten wir die relative Expression von drei AcrAB-TolC-Multidrug-Efflux-Pumpen-Genen (MDEP) aufgrund ihrer Rolle bei der Entfernung von Antibiotika aus der Bakterienzelle . Wir fanden eine signifikant erhöhte Expression (≥ vierfach) jedes dieser drei Gene in 2-Stunden- gegenüber 6-Stunden-NRel, was auf eine größere Aktivität dieser Effluxpumpe zum 2-Stunden-Zeitpunkt hindeutet. Interessanterweise wurde jedoch auch das Gen, das für den Repressor dieser Effluxpumpe, acrR, kodiert, in 2 h NRel signifikant hochreguliert (11-fach). Angesichts der paradoxen Natur dieser Ergebnisse im Hinblick auf die signifikante A/C-Empfindlichkeit haben wir überlegt, ob die Sammlung von RNA genau zu dem Zeitpunkt, zu dem die biologische Aktivität der relativen Antibiotika-Abtötung beurteilt wurde (z. B. 2 oder 6 Stunden), möglicherweise dazu beigetragen hätte die falsche „Zeitaufnahme“, um die tatsächliche Aktivität dieser bestimmten Genprodukte abzuschätzen.

Daher haben wir auch RNA nach 30 m Biofilm-Exposition gegenüber α-DNABII gewonnen (ergänzende Abbildung S1), was möglicherweise ein besserer Ersatz für die vergleichende Genproduktaktivität ist. Wir fanden eine signifikant erhöhte Transkripthäufigkeit für acrA, acrG und tolC bei 30 m im Vergleich zu 2 h (p = 0,004 für acrA oder p = 0,0005 für acrG und tolC). Darüber hinaus gab es bei 30 m im Vergleich zu 2 h eine signifikant größere acrR-Transkripthäufigkeit (p ≤ 0,0001). Leider lieferten diese zusätzlichen Daten keine Klarheit über die Rolle dieser Effluxpumpe bei der beobachteten erhöhten Empfindlichkeit von α-DNABII NRel in diesem NTHI-Stamm gegenüber A/C, deuteten jedoch darauf hin, dass insgesamt das relative biologische Nettoergebnis dieser vier Gene vorliegt Produkte begünstigten die Aktivität des Repressors, wie andere ebenfalls beobachtet haben30. Es ist jedoch auch möglich, dass die Rolle von AcrR bei diesem Stamm nicht klar ist. Darüber hinaus ist es wichtig anzumerken, dass die zeitliche Empfindlichkeit von Genexpressionsänderungen und wie sich diese auf die relative Proteinexpression und/oder die Stabilität oder Lebensdauer dieser Genprodukte (und wahrscheinlich auch anderer) auswirken könnten, hier möglicherweise eine zusätzliche Rolle spielten.

Während wir Amoxicillin mit dem β-Lactamase-Inhibitor Clavulansäure verwendeten, waren wir angesichts der beobachteten signifikanten Empfindlichkeit gegenüber Abtötung durch A/C in 2 h NRel an der relativen Expression von bla interessiert, das den NTHI-β-Lactamase-Vorläufer kodiert. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen dem 2-Stunden- und dem 6-Stunden-NRel, was darauf hindeutet, dass dieses Genprodukt wahrscheinlich keine Rolle bei der beobachteten vorübergehenden signifikanten Empfindlichkeit gegenüber Klimaanlage spielt.

Schließlich haben wir drei Gene profiliert, die an der bakteriellen Resistenz gegen oxidativen Stress beteiligt sind: hktE, pdgX und sodA, da die zuvor nachgewiesene schnelle Wirksamkeit von α-DNABII bei therapeutischer Anwendung in drei präklinischen Modellen menschlicher Erkrankungen ohne Zusatz von Antibiotika24,26 berücksichtigt wurde. 27, wir waren neugierig auf die mögliche Anfälligkeit von NTHI NRel, neben Antibiotika auch Effektoren des angeborenen Immunsystems zu beherbergen. Während es keinen signifikanten Unterschied in der relativen sodA-Genexpression gab, waren hktE und pdgX in 2-Stunden-NRel im Vergleich zu 6-Stunden-NRel signifikant um das Vierfache herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der α-DNABII NTHI NRel-Phänotyp möglicherweise auch eine geringere Fähigkeit zur Minderung von oxidativem Stress beinhaltet. Daher wollten wir nun die relative Empfindlichkeit von 2-Stunden- gegenüber 6-Stunden-NRel gegenüber der Abtötung durch menschliche PMNs bestimmen.

Um die relative Fähigkeit aktivierter menschlicher PMNs zu beurteilen, 2-Stunden- oder 6-Stunden-NRel abzutöten, haben wir die Verwendung der humanisierten Version unseres monoklonalen Anti-Spitzen-Chimären-Antikörpers („HuTipMab“)50 eingeführt, während wir weiterhin den murinen monoklonalen (α- DNABII), die wir bisher verwendet hatten, werden jetzt aber der Klarheit halber als „MsTipMab“ bezeichnet. Dieser direkte Vergleich von HuTipMab mit MsTipMab ermöglichte es uns, unsere Bewertung dahingehend zu erweitern, ob die Humanisierung eine bewertete Aktivität dieses Monoklonals, einschließlich der Induktion des NRel-Phänotyps, beeinträchtigte. Wir fanden heraus, dass die Anfälligkeit von planktonischem NTHI für die Abtötung durch menschliche PMNs bei etwa 33 % lag (Abb. 3A, offene Kästchensymbole), die von 2-Stunden-NTHI-NRel, unabhängig davon, ob es durch Ms- oder HuTipMab induziert wurde, deutlich höher war (65 % bzw 62 %, p ≤ 0,0001) (Abb. 3A).

2 h α-DNABII NTHI NRel waren signifikant anfällig für NADPH-Oxidase-empfindliche intrazelluläre Abtötung durch menschliche PMNs. Hier haben wir die relative Fähigkeit aktivierter menschlicher PMNs bestimmt, isogene planktonische, 2- oder 6-stündige α-DNABII-NTHI-NRel abzutöten. (A) Zum Zeitpunkt von 2 Stunden wurden ~ 33 % des planktonischen NTHI durch aktivierte menschliche PMNs abgetötet. Unabhängig davon, ob sie durch MsTipMab oder HuTipMab induziert wurden, waren NTHI-NRel jedoch signifikant (p ≤ 0,0001) anfälliger für die Abtötung durch menschliche PMNs, was durch eine Abtötung von ca. 65 % bzw. ca. 62 % belegt wurde. Die DPI-Behandlung menschlicher PMNs reduzierte die Anfälligkeit für 2-Stunden-NTHI-NRel, unabhängig davon, ob sie durch MsTipMab oder HuTipMab induziert wurde, signifikant, was durch eine Abtötung von ~ 35 % bzw. ~ 32 % belegt wurde (p ≤ 0,001). (B) Nach 6 Stunden hatte die Verwendung von DPI zur Hemmung der intrazellulären NADPH-Oxidase keinen Einfluss auf die relative Fähigkeit aktivierter menschlicher PMNs, weder das MsTipMab- noch das HuTipMab-induzierte NRel abzutöten. Es gab keinen Unterschied in der Anfälligkeit für die Abtötung durch DPI-behandelte PMNs für planktonisches NTHI im Vergleich zu 2-Stunden-NRel oder im Vergleich zu 6-Stunden-NRel (p > 0,05). Rote Linien geben den Mittelwert an. Die statistische Signifikanz beim Vergleich von planktonischem NTHI, das durch unbehandelte oder mit DPI behandelte PMNs abgetötet wurde, wurde über einen ungepaarten zweiseitigen t-Test oder eine zweiseitige ANOVA mit Šidák-Korrektur (Panels AB) bestimmt. ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um mittlere prozentuale Abtötungen aus mindestens sechs separaten Tests, die jeweils an separaten Tagen mit zwei bis drei technischen Wiederholungen pro Datenpunkt durchgeführt wurden.

Um als nächstes festzustellen, ob die verstärkte Abtötung von 2-h-NRel durch menschliche PMNs wahrscheinlich auf ihre begrenzte relative Fähigkeit zur Minderung von oxidativem Stress zurückzuführen ist (aufgrund der erheblichen Herunterregulierung von hktE und pdgX), haben wir den intrazellulären NADPH-Oxidase-Inhibitor Diphenyleniodoniumchlorid eingebaut (DPI)51 in unseren PMN-Abtötungstest. Wenn Neutrophile mit DPI inkubiert wurden, waren durch Ms- oder HuTipMab induzierte 2-Stunden-NRel nun deutlich weniger anfällig für die Abtötung (35 % bzw. 32 %, p = 0,0006) im Vergleich zur Abtötung durch unbehandelte PMNs (Abb. 3A, geschlossene schwarze und). graue Kreise). Unabhängig davon, ob durch Inkubation mit Ms- oder HuTipMab induziert, unterschied sich die Abtötung von 2-Stunden-NRel durch DPI-behandelte PMNs nun nicht mehr statistisch signifikant von der Abtötung von planktonischem NTHI durch vorbehandelte PMNs (p = 0,36). DPI hatte keinen Einfluss auf die Abtötung von Plankton.

In 6-Stunden-NRel hatte die DPI-Behandlung keinen Einfluss auf die relative Fähigkeit menschlicher PMNs, diese Bakterien nach der Phagozytierung abzutöten, da es keinen signifikanten Unterschied in der Anfälligkeit für die Abtötung durch DPI-behandelte PMNs im Vergleich zu unbehandelten PMNs gab (p = 0,3) ( Abb. 3B). Wie im Assay von 2-Stunden-NRel beobachtet, gab es keinen Unterschied in der Anfälligkeit für die Abtötung von planktonischem NTHI durch DPI-behandelte PMNs im Vergleich zu 6-Stunden-NRel (p = 0,10), und die Abtötung von planktonischem NTHI schien durch die Zugabe von DPI weitgehend unbeeinflusst zu sein. Dies deutete auf einen größeren Einfluss extrazellulärer Mechanismen der PMN-vermittelten Abtötung von planktonischem NTHI hin. Darüber hinaus gab es keinen Unterschied in der Anfälligkeit für die Abtötung durch DPI-behandelte PMNs in 2 Stunden im Vergleich zu 6 Stunden NRel (p = 0,07).

Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass α-DNABII NTHI NRel zusätzlich zu der vorübergehenden, aber deutlich erhöhten Empfindlichkeit gegenüber der Abtötung durch Klimaanlagen auch sehr anfällig für die intrazelluläre Abtötung durch aktivierte menschliche PMNs sind, und zwar insbesondere auf NADPH-Oxidase-empfindliche Weise . Dieses Merkmal wurde im 6-Stunden-NRel nicht mehr festgestellt, was auf eine weitere vorübergehende Anfälligkeit dieses Phänotyps schließen lässt.

Angesichts der Tatsache, dass ompP2 in 2-Stunden-NRel im Vergleich zu 6-Stunden-NRel deutlich hochreguliert war, fragten wir uns, ob diese erhöhte Expression des Hauptporins der NTHI-Außenmembran mit einer größeren Membranpermeabilität korrelieren könnte. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir den nukleinsäureinterkalierenden grün fluoreszierenden Farbstoff SYTOX Green. SYTOX Green kann nur dann auf das NTHI-Genom zugreifen, wenn sowohl die innere als auch die äußere Membran dieses gramnegativen Bakteriums durchlässig sind. Daher wurde ein erhöhtes Fluoreszenzsignal als Ersatz für die relative Durchlässigkeit der äußeren Membran verwendet.

In einem Assay sowohl des 2-Stunden- als auch des 6-Stunden-NRel war die Negativkontrolle (planktonisch gewachsenes NTHI in der mittleren Log-Phase) unmittelbar nach der Exposition gegenüber SYTOX Green minimal fluoreszierend und behielt dieses niedrige Fluoreszenzniveau dann während des gesamten 120-m-Assayzeitraums bei (Abb . 4A und B, schwarze Linien). Umgekehrt zeigte die Positivkontrolle (planktonisch gewachsenes NTHI in der mittleren Log-Phase, das mit Triton RFU/CFU innerhalb von ca. 30–45 m (Abb. 4A und B, graue Linien). Auch das 2-Stunden-NRel zeigte unmittelbar nach der Exposition gegenüber SYTOX Green ein geringes Fluoreszenzniveau, nahm dann aber im Laufe der Zeit stetig zu und erreichte ein maximales Plateau bei 75 m, das sich dem der Positivkontrolle näherte (Abb. 4A, grüne Linie). Während des gesamten Tests fluoreszierte 2-Stunden-NRel durchweg deutlich stärker als planktonisch gewachsenes NTHI (p ≤ 0,0001), was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der Außenmembran in 2-Stunden-NRel hindeutete.

Die Durchlässigkeit der Bakterienmembran war bei 2-Stunden-α-DNABII-NRel deutlich höher als bei denen, die für NTHI plus drei weitere menschliche Krankheitserreger planktonisch gezüchtet wurden. Die relative emittierte Fluoreszenz wurde mit dem Nukleinsäure-Interkalationsfarbstoff SYTOX Green als Proxy für die Beurteilung der Außenmembranpermeabilität von α-DNABII NRel gemessen. In jedem Assay dienten planktonisch gewachsene Bakterien mit oder ohne Behandlung mit Triton X-100 als Positiv- bzw. Negativkontrolle. (A) 2 h α-DNABII NTHI NRel waren über den 120 m langen Testzeitraum signifikant (p ≤ 0,0001) fluoreszierender als die Negativkontrolle. (B) Nach 6 Stunden ähnelte die gezeigte Fluoreszenz von α-DNABII NTHI NRel der von planktonisch gewachsenem NTHI. Die beobachtete erhöhte Membranpermeabilität des 2-Stunden-, aber nicht des 6-Stunden-α-DNABII-NTHI-NRel stützte die beobachtete vorübergehende und deutlich höhere Empfindlichkeit des 2-Stunden-NRel gegenüber Klimaanlage, die in der 6-Stunden-NRel-Population nicht mehr beobachtet wurde. (CE) Um festzustellen, ob eine erhöhte Außenmembranpermeabilität ein universelleres Merkmal von α-DNABII-NRel sein könnte, haben wir auch die Membranpermeabilität von identisch erzeugtem 2-Stunden-α-DNABII-NRel von zwei weiteren gramnegativen Krankheitserregern und einem grampositiven Krankheitserreger untersucht. α-DNABII E. coli NRel (Panel C) zeigte im Vergleich zur Negativkontrolle eine deutlich erhöhte Fluoreszenz (p ≤ 0,01), ebenso wie α-DNABII P. aeruginosa NRel (Panel D) (p ≤ 0,01) und MRSA NRel (Panel E). ) (p ≤ 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten stellen drei separate Tests dar, die an drei verschiedenen Tagen mit drei technischen Dreifachansätzen pro Test durchgeführt wurden. Relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) wurden auf CFU der jeweiligen Bakterienpopulation normalisiert, die der Testplatte hinzugefügt wurde. Statistische Analysen der jeweiligen Dreifachläufe wurden mithilfe eines linearen gemischten Modells mit wiederholten Messungen zum Vergleich der Zeitverlaufsdaten zwischen den Werten von NRel und denen der Negativkontrolle berechnet.

Da 6-Stunden-NRel eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber A/C oder T/S zeigten (siehe Abb. 1), wurden diese 6-Stunden-NRel auch getestet, um ihre relative Durchlässigkeit der äußeren Membran zu bestimmen (Abb. 4B). Während sich planktonisches NTHI (mit und ohne Triton ). Diese Daten legen nahe, dass im Einklang mit der erhöhten A/C-Empfindlichkeit auch die in 2 Stunden NRel beobachtete erhöhte Außenmembranpermeabilität vorübergehend war und sich nach 6 Stunden aufgelöst hatte.

Um sicherzustellen, dass die beobachtete erhöhte Außenmembranpermeabilität kein NRel-Merkmal war, das ausschließlich für NTHI als Ganzes oder für dieses bestimmte NTHI-Isolat galt, haben wir auch identisch erzeugte NRel von drei weiteren Krankheitserregern bewertet [Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oder ein Methicillin- resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)], wie er durch 2-stündige Exposition der jeweiligen 16-Stunden-Biofilme gegenüber α-DNABII induziert wird. Während jedes Bakterium ein einzigartiges Muster zeigte, zeigten 2 h α-DNABII NRel von E. coli, P. aeruginosa und MRSA alle ein signifikant erhöhtes Fluoreszenzsignal (p = 0,007 für E. coli NRel, p = 0,005 für P. aeruginosa NRel, S = 0,02 für MRSA NRel) im Vergleich zu ihren planktonisch gewachsenen Gegenstücken über den 120-m-Testzeitraum (Abb. 4C-E). Diese Daten legen nahe, dass ein vorübergehender Phänotyp einer erhöhten Außenmembranpermeabilität möglicherweise ein gemeinsames Merkmal von Bakterien ist, die durch die Wirkung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen die DNABII-Strukturproteine ​​der Biofilmmatrix gerichtet ist, aus dem Biofilmaufenthaltsort freigesetzt werden.

Der Bedarf an wirksameren Therapieansätzen oder vorzugsweise Präventionsstrategien zur Bekämpfung hartnäckiger biofilmbedingter Krankheiten kann nicht genug betont werden. Mit Biofilmen verbundene Krankheiten verschärfen die weltweite große öffentliche Gesundheitskrise der Antibiotikaresistenz, denn trotz der Tatsache, dass in Biofilmen lebende Bakterien gegenüber einer Antibiotikabehandlung erheblich widerspenstig sind, werden Personen mit diesen Krankheiten dennoch häufig Antibiotika verschrieben, die zu unserem sehr begrenzten Repertoire an Behandlungsmöglichkeiten gehören52 ,53,54. Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, sind nicht nur sehr widerstandsfähig gegenüber Antibiotika, sondern die Resistenz von Biofilmen gegenüber der Beseitigung durch Immuneffektoren erhöht auch die Komplexität, indem sie die Fähigkeit des Wirts, mit Biofilmen in Zusammenhang stehende Krankheiten zu bekämpfen, erheblich erschwert55,56,57. Um diese Probleme anzugehen, umfasst eine dieser Strategien den Einsatz von Methoden, die im Biofilm lebende Bakterien aus ihrer schützenden Festung befreien können, um ihre Abtötung durch den Wirt zu erleichtern, und bei Bedarf durch die gleichzeitige Verabreichung herkömmlicher Antibiotika, die jetzt möglicherweise wesentlich wirksamer sind .

Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir uns auf eine wichtige Strukturkomponente der bakteriellen Biofilmmatrix konzentriert, die bakteriellen DNA-bindenden Proteine ​​der DNABII-Familie19,20,21. Die beiden DNABII-Proteine ​​HU und IHF binden an gekreuzte Stränge extrazellulärer DNA in der Biofilmmatrix und stabilisieren so effektiv diese Struktur22. Wenn wir einen Biofilm, der entweder einzeln oder durch zwei von sechs verschiedenen Krankheitserregern der Atemwege sowie durch einen der hoch antibiotikaresistenten Vertreter der ESKAPEE-Krankheitserreger gebildet wird, mit einem monoklonalen Antikörper inkubieren, der gegen die schützenden DNA-bindenden „Spitzen“ gerichtet ist. eines DNABII-Proteins kollabiert der Biofilm schnell22,23,24,25,40. Durch diesen Zusammenbruch werden alle getesteten im Biofilm ansässigen Krankheitserreger in einen äußerst anfälligen, aber vorübergehenden Zustand versetzt, in dem sie nun in vitro deutlich anfälliger für häufig verwendete Antibiotika mehrerer Klassen und in vivo auch für angeborene Immuneffektoren sind24,25,26,27, 35,36,58,59. Diese erhöhte Anfälligkeit wird nicht nur im Vergleich zu ihren isogenen Gegenstücken im Biofilmzustand beobachtet, sondern, was noch wichtiger ist, sie ist auch größer als bei denen im planktonischen Zustand.

Insbesondere haben wir in einem früheren Bericht gezeigt, dass nach 15-minütiger oder 2-stündiger Inkubation eines Biofilms, der aus einem klinischen Isolat von NTHI mit α-DNABII gebildet wurde, die resultierenden NRel deutlich anfälliger für die Abtötung durch Klimaanlagen waren als sie zum Töten durch T/S36. Insgesamt war es nicht überraschend, dass die NRel empfindlicher auf Tötungen reagierten als ihre im Biofilm lebenden Artgenossen. Allerdings war es in der Tat bemerkenswert, dass diese NRel auf beide Antibiotika genauso oder deutlich empfindlicher reagierten als ihre isogenen planktonisch gewachsenen Gegenstücke36. Hier untersuchten wir die beobachtete bevorzugte größere Empfindlichkeit von NRel gegenüber der Abtötung durch das β-Lactam-Antibiotikum A/C gründlicher als durch das Sulfonamid T/S.

Insgesamt zeigten die hier präsentierten Daten die Kinetik des A/C-empfindlichen α-DNABII-NRel-Phänotyps nach der Freisetzung aus dem Aufenthaltsort in einem Biofilm, der vom NTHI-Stamm 86-028NP durch ein murines monoklonales Protein gebildet wurde, das gegen ein Biofilm-Strukturmatrixprotein des DNABII gerichtet ist, deutlicher Familie. Wir fanden heraus, dass diese signifikante Empfindlichkeit innerhalb von 5 Minuten nachweisbar ist und in vitro etwa 6 Stunden anhält. Danach ist die NRel-Population nicht mehr selektiv empfindlicher gegenüber Klimaanlagen.

Die Untersuchung der relativen Expression mehrerer Gene, deren Produkte bekanntermaßen zur β-Lactam-Empfindlichkeit beitragen, ergab mehrere Faktoren, die wahrscheinlich zur erhöhten Anfälligkeit von α-DNABII NTHI NRel gegenüber A/C beigetragen haben. In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass NTHI innerhalb von 15 Minuten nach der Freisetzung aus dem Biofilm durch Anti-DNABII eine erhöhte Expression von Genen zeigt, die für Bakterien in der Lag-Phase charakteristisch sind, einem Zeitraum, in dem Bakterien an der Reparatur ihrer Zellhüllen und Membranen beteiligt sind dadurch sind sie auch membrandurchlässiger41,60. Hier haben wir bestätigt, dass α-DNABII NTHI NRel zum 2-Stunden-Zeitpunkt immer noch Bakterien in der Verzögerungsphase zu imitieren schien, was durch eine signifikante Hochregulierung derselben drei kanonischen Verzögerungsphasen-Gene im Vergleich zu NRel, der zum 6-Stunden-Zeitpunkt wiederhergestellt wurde, belegt wurde Punkt. Dass α-DNABII NTHI NRel nie eine wesentlich größere Anfälligkeit für T/S zeigte, wurde wahrscheinlich durch die Erkenntnis erklärt, dass Bakterien in der Lag-Phase nicht sehr aktiv in der Proteinsynthese sind (ein Ziel für die Sulfonamid-Antibiotikaklasse wie T/S)61, 62,63.

In früheren Daten unserer Gruppe36 zeigte eine vollständige proteomische Analyse von 15-minütigem α-DNABII NRel einen Anstieg des Peptidoglycan-Syntheseproteins MurB, was auf eine veränderte Zusammensetzung der Zellhülle hindeutet36,64. Die Modifikation in der α-DNABII-NTHI-NRel-Zellhülle wurde durch die hier gezeigten neuen Ergebnisse einer erhöhten Transkripthäufigkeit von ompP2 weiter bestätigt, das für das Hauptporin der NTHI-Außenmembran kodiert und somit einen Mechanismus für den Eintritt von Antibiotika in die Bakterienzelle bereitstellt. Darüber hinaus stimmte diese erhöhte Expression von ompP2 mit unserem gleichzeitigen Nachweis eines zeitgleichen vorübergehenden Anstiegs der Außenmembranpermeabilität in neu freigesetztem NTHI zum 2-Stunden-Zeitpunkt überein, was durch relative Fluoreszenz bei Inkubation mit SYTOX Green belegt wurde.

Die hier vorgestellten neuen Daten zeigten auch, dass ein signifikanter Anstieg der relativen Expression von drei profilierten PBPs voraussichtlich auch zur erhöhten Antibiotikaempfindlichkeit von α-DNABII NTHI NRel beigetragen hat, da β-Lactame auf PBPs abzielen44,45,46. Tatsächlich zeigen Bakterien, die Mutationen in der Transpeptidaseregion dieses kodierten Proteins entwickelt haben, spezifisch für die relativ erhöhte Expression des H. influenzae-ftsI-Gens eine erhöhte β-Lactam-Resistenz44,45,46,47,48. Schließlich zeigte 2-h-α-DNABII NTHI NRel eine begrenzte Expression von bla, dem β-Lactamase-Vorläufer, was auf einen weiteren potenziellen Faktor für die erhebliche Empfindlichkeit gegenüber Abtötung durch A/C hindeutet, wie selbst in Abwesenheit von Clavulansäure, NTHI NRel wäre nur begrenzt in der Lage, dieses Antibiotikum abzubauen, sobald es in die Zelle gelangt ist65. Dass neu aus ihrer schützenden Biofilmfestung freigesetzte NTHI Bakterien in der Lag-Phase zu imitieren scheinen und eine signifikante Hoch- oder Herunterregulierung zahlreicher profilierter Gene zeigten, kann durch die Tatsache erklärt werden, dass Bakterien, die sich in einem Biofilm befinden, oft metabolisch im Ruhezustand sind8. Daher gehen wir davon aus, dass Bakterien, wenn sie durch die Wirkung von Anti-DNABII schnell aus dem Biofilm freigesetzt werden, in einen Zustand freigesetzt werden, in dem sie vorübergehend nicht in der Lage sind, die Tötungsfunktionen von Antibiotika und menschlichen PMNs zu vermitteln. Während diese Abwehrfunktionen letztendlich wiedererlangt werden, bietet der NRel-Phänotyp dennoch eine Gelegenheit für eine wirksamere Ausrottung der ehemals im Biofilm ansässigen Bakterien.

Während bisher über eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Antibiotika als Merkmal des neu freigesetzten Phänotyps für mehrere Bakterien berichtet wurde23,30,31,34,35,36, waren wir auch daran interessiert zu untersuchen, ob es möglicherweise auch Hinweise auf eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Immuneffektoren gibt. Bisher waren wir besonders an der Anfälligkeit für angeborene Immuneffektoren interessiert und haben in drei verschiedenen präklinischen Modellen menschlicher Erkrankungen gezeigt, dass Bakterien und jeglicher Biofilm bei der Neufreisetzung aus einem Biofilm durch die Wirkung eines DNABII-gerichteten Antikörpers auftreten Reste werden vom jeweiligen Wirt schnell beseitigt, auch wenn kein Antibiotikum zugesetzt wird. Wir haben dies für Schleimhautbiofilme berichtet, die im Mittelohr durch NTHI in einem Chinchilla-Modell einer experimentellen Mittelohrentzündung gebildet wurden, für aggregierte Biofilme, die in der murinen Lunge durch Pseudomonas aeruginosa gebildet wurden, und für Biofilme, die in der Mundhöhle durch Aggregatibacter actinomycetemcomitans in einem Rattenmodell für Periimplantitis gebildet wurden24 ,25,26,27. Diese antibiotikafreie effiziente Bakterienbeseitigung und schnelle Krankheitsheilung legten nahe, dass angeborene Immuneffektoren, insbesondere PMNs, wahrscheinlich beteiligt waren. Unser Interesse wurde weiter geweckt, als wir hier zeigten, dass α-DNABII NTHI NRel eine vorübergehende deutliche Herunterregulierung von zwei Enzymen (einer Katalase und einem Peroxiredoxin-Glutaredoxin) zeigte, die für die Linderung von oxidativem Stress wichtig sind66,67,68,69.

Daher haben wir die relative Abtötung von α-DNABII NTHI NRel durch menschliche PMNs angesichts ihrer Rolle als erste Verteidigungslinie gegen unerwünschte Krankheitserreger bewertet. PMNs, die an die Infektionsstelle gelangen, zeigen auf vielfältige Weise antimikrobielle Aktivitäten. Ihr wichtigstes Arsenal ist die extrazelluläre Abtötung durch NETose sowie die intrazelluläre Abtötung durch reaktive Sauerstoffspezies nach Phagozytose70,71. Wir fanden heraus, dass neu durch α-DNABII aus dem Biofilm freigesetzte NTHI zwar vorübergehend, aber dennoch sehr anfällig für die Abtötung durch aktivierte menschliche PMNs waren. Während diese Abtötung insgesamt wahrscheinlich sowohl auf extra- als auch auf intrazelluläre Weise zurückzuführen war, kam es zu einer signifikanten Verringerung der Abtötung, wenn PMNs mit dem spezifischen intrazellulären NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI51 vorbehandelt wurden. Dieser Befund stimmte gut mit der ebenfalls vorübergehend deutlich reduzierten Expression von hktE und pdgX durch die NRel-Population überein. Durch den Einsatz von DPI konnten wir auch die eingeschränkte Funktionalität von PMNs nachahmen, die von Personen mit chronischer granulomatöser Erkrankung gewonnen wurden, die außerdem eine erhöhte Anfälligkeit für Pilz- und Bakterieninfektionen aufweisen, einschließlich solcher, die durch Krankheitserreger verursacht werden, die äußerst widerspenstige Biofilme bilden können51,72. Abschließend ist anzumerken, dass es keinen Unterschied in der erhöhten Anfälligkeit für die Abtötung durch PMNs gab, unabhängig davon, ob NTHI durch die Wirkung des murinen oder humanisierten monoklonalen α-DNABII aus dem Biofilm freigesetzt wurden. Somit ergänzen diese Daten andere, die zeigen, dass der Humanisierungsprozess die Aktivität dieses monoklonalen Antikörpers in keiner Weise verringert hat, die bisher getestet wurde27,35.

Um festzustellen, ob spezifische NRel-Merkmale bei anderen Bakterien als NTHI möglicherweise umfassender nachweisbar sind, untersuchten wir auch die Eigenschaft einer erhöhten Außenmembranpermeabilität für drei weitere menschliche Krankheitserreger, die durch die Wirkung des gegen ein DNABII-Protein gerichteten humanisierten monoklonalen Bakteriums aus dem Biofilm freigesetzt wurden. Dieses besondere Merkmal wurde tatsächlich von α-DNABII NRel von zwei weiteren gramnegativen Krankheitserregern, E. coli und P. aeruginosa, sowie von einem Isolat des grampositiven Methicillin-resistenten Krankheitserregers S. aureus geteilt, was auf eine vorübergehende Erkrankung schließen lässt Eine erhöhte Durchlässigkeit der Außenmembran könnte ein gemeinsames Merkmal des α-DNABII-NRel-Phänotyps sein. Eine mögliche Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass wir nicht garantieren können, dass α-DNABII NRel ausschließlich aus Bakterien bestand, die neu aus dem Biofilm-Residenz freigesetzt wurden, da sie möglicherweise auch Bakterien umfassten, die im Rahmen der natürlichen Biofilm-Remodellierung den Biofilm-Residenz verlassen haben73. Diese Möglichkeit schränkte jedoch nicht unsere Fähigkeit ein, unterschiedliche Phänotypen dieser neu aus dem Biofilm freigesetzten Bakterien im Vergleich zu ihren planktonisch gewachsenen Gegenstücken zu beobachten und zu beschreiben.

Insgesamt unterstützen die hier bereitgestellten neuen Daten die weitere Validierung eines therapeutischen Ansatzes, bei dem wir vorschlagen, den humanisierten monoklonalen Antikörper einem Individuum mit einer widerspenstigen Biofilminfektion zuzuführen, um das angeborene Immunsystem des Wirts in die Lage zu versetzen, die neu aus dem Biofilm freigesetzten Bakterien effektiv auszurotten, idealerweise in eine kontrollierte Art und Weise. Bisher unterstützen drei separate präklinische Krankheitsmodelle diese antibiotikafreie Strategie24,25,26. Wenn dies jedoch erforderlich oder gerechtfertigt ist und innerhalb von Minuten eine signifikante Antibiotikaempfindlichkeit festgestellt wurde, würden wir einen kombinatorischen Ansatz vorschlagen, bei dem ein jetzt wirksames Antibiotikum gleichzeitig verabreicht wird, um die schnelle Abtötung der Bakterien zu fördern, wenn sie aus dem pathogenen Biofilm freigesetzt werden. In einer Welt mit hoher Antibiotikaresistenz, in der bakterielle Biofilme hartnäckig sind und sich sowohl der konventionellen Antibiotikabehandlung als auch der Immunabwehr des Wirts widersetzen, könnte dieser pathogenagnostische Anti-DNABII-Ansatz eine leistungsstarke und breit wirksame neue Strategie darstellen, die vielversprechendes therapeutisches Potenzial bietet, wenn keine neuen vorhanden sind Entwicklung von Antibiotika zur Ausrottung biofilmbedingter Krankheiten.

Anonymisierte menschliche Blutspenden von gesunden erwachsenen Probanden aus dem demografischen Spektrum von Zentral-Ohio wurden unter der Schirmherrschaft des Research Institute Blood Donor Services des Nationwide Children's Hospital durchgeführt, nachdem eine schriftliche Einwilligung eingeholt worden war. Aus diesen Blutproben wurden PMNs zur Verwendung in Studien isoliert, die in unserem Labor gemäß dem Protokoll Nr. IBS-00000449 des Nationwide Children's Hospital Institutional Biosafety Committee (IBC) durchgeführt und gemäß diesem genehmigt wurden. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften des Nationwide Children's Hospital Research Institute Blood Donor Services and Institutional Biosafety Committee durchgeführt.

Der nicht typisierbare Haemophilus influenzae (NTHI)-Stamm 86-028NP37,38 wurde seit seiner ursprünglichen Isolierung aus dem Nasopharynx eines Kindes, bei dem aufgrund einer chronischen Mittelohrentzündung ein Paukenröhrchen eingeführt wurde, bei Passage Nr. 4 auf künstlichem Medium in LN2 eingefroren gehalten. NTHI 86-028NP wurde in Hirn-Herz-Infusionsbrühe gezüchtet, ergänzt (sBHI) mit Hämin (2 µg/ml) (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. H9039) und β-NAD (2 µg/ml) (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr . N1511) bei 37 °C mit 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre. Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) (klinisches Isolat von einem Kind mit Mukoviszidose) oder der Pseudomonas aeruginosa-Stamm 142-135 (University of North Texas) wurden auf Tryptic-Soja-Agar (TSA) oder in Tryptic-Soja-Brühe gezüchtet. Der Escherichia coli-Stamm UTI8922 wurde auf Lysogeny Broth-Agar oder in Lysogeny Broth (LB) für 18–24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre gezüchtet.

Ein muriner (Rockland Immunochemicals, Inc., Philadelphia, PA)24 oder humanisierter (Lake Pharma, Inc., San Carlos, CA)35,50 monoklonaler Antikörper des IgG-Isotyps gegen ein Tip-Chimer-Peptid, das schützende Epitope des IgG nachahmen soll DNA-bindende „Spitzen“ der Alpha- und Beta-Untereinheiten eines bakteriellen DNABII-Proteins wurden für uns im Auftrag von Rockland Immunochemicals, Inc. bzw. Lake Pharma, Inc. hergestellt. Diese monoklonalen Antikörper werden als MsTipMab (Maus) oder HuTipMab (humanisiert) bezeichnet.

Zweieinhalb ml NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 oder MRSA mit 2 × 105 KBE/ml wurden in separate 10 cm2 flache Gewebekulturröhrchen (TPP, Trasadingen, Schweiz, Kat.-Nr. 91243) ausgesät und können sich etablieren, wenn sie 16 Stunden lang statisch bei 37 °C mit 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre im jeweiligen Medium inkubiert werden. Nach 16 Stunden wurden die Röhrchen im Inkubator vorsichtig umgedreht. Medium, das nicht anhaftende Bakterien enthielt, wurde abgegossen. Während es umgedreht wurde, wurden 2,5 ml äquilibrierte (37 °C, 5 % CO2) phosphatgepufferte Dulbecco-Kochsalzlösung ohne Calcium oder Magnesium (DPBS) hinzugefügt. Die Röhrchen wurden um 360° gedreht, um weitere nicht anhaftende Bakterien vorsichtig zu entfernen, und das DPBS wurde wie oben abgegossen. Um α-DNABII NTHI NRel zu erzeugen, wurden gewaschene Biofilme bei 37 °C mit 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre für 1 m, 5 m, 15 m, 2 h, 4 h oder 6 h mit entweder MsTipMab oder HuTipMab bei a inkubiert Konzentration von 5 µg Antikörper verdünnt in sBHI/0,8 cm2. Die Anzahl der NTHI, die zu einem bestimmten Zeitpunkt durch α-DNABII aus der Biofilmresidenz freigesetzt wurden oder in den Flüssigkeiten über dem Biofilm wachsen, ist in der Ergänzungstabelle S1 angegeben. Um α-DNABII E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 oder MRSA NRel zu erhalten, wurden entsprechende 16-Stunden-Biofilme bei 37 °C, 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre für 2 Stunden mit HuTipMab in einer Konzentration von 5 µg Antikörper inkubiert verdünnt in sBHI/0,8 cm2.

Um die Kinetik der relativen Empfindlichkeit des α-DNABII NTHI NRel gegenüber antibiotikavermittelter Abtötung zu bestimmen, inkubierten wir das NRel entweder mit Amoxicillin (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. 31586) und Clavulanat-Lithium (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. 1134426). ) (A/C) oder mit Trimethoprim (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. T7883) und Sulfamethoxazol (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. 723-46-6) (T/S) wie zuvor beschrieben, mit Modifikationen36. Wie oben wurden 16-Stunden-NTHI-Biofilme hergestellt, gewaschen und in Gewebekulturröhrchen 1 Minute, 5 Minuten, 15 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden oder 6 Stunden lang behandelt, um α-DNABII-NTHI-NRel unterschiedlichen „Alters“ zu erhalten. Anschließend wurden α-DNABII NTHI NRel vorsichtig in Eppendorf-Röhrchen gegossen und 2 Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt, um Bakterienaggregate zu dispergieren. Aliquots von 90 µL der Bakteriensuspensionen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, gefolgt von 10 µL A/C oder T/S. Wir haben die Antibiotikakonzentration, die die Abtötung von NTHI in den Flüssigkeiten aufrechterhalten würde, die einen Biofilm in unserem Kultursystem überlagern, vorab auf etwa 15 bis 25 % festgelegt, damit wir jede verstärkte Abtötung von α-DNABII NTHI NRel36 leicht erkennen und quantifizieren können . Die Konzentrationen der zu jedem Zeitpunkt verwendeten Antibiotika sind in Tabelle 1 aufgeführt. Als Negativkontrolle wurden 10 µL des Antibiotika-Verdünnungsmittels allein gleichzeitig in die jeweiligen Vertiefungen der 96-Well-Testplatte gegeben. Bakterien und Antibiotika wurden 2 Stunden lang statisch bei 37 °C, 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Nach 2 Stunden wurde die 96-Well-Platte 2 Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt, um etwaige Bakterienaggregate aufzubrechen. Jede Vertiefung wurde dann seriell verdünnt und auf Schokoladenagar ausgestrichen, um koloniebildende Einheiten (KBE)/ml zu bestimmen. Die prozentuale Überlebensrate wurde durch Vergleich der KBE/ml des Verdünnungsmittels allein („ohne Antibiotika“) mit den mit Antibiotika behandelten Bakterien berechnet. KBE/ml der Antibiotika-Vertiefungen wurden durch KBE/ml der Verdünnungsmittel-Vertiefungen dividiert, mit 100 multipliziert, dann wurde dieser Wert von 100 abgezogen, um die prozentuale Abtötung zu berechnen. Die Experimente wurden mit zwei bis drei technischen Dreifachversuchen pro Assay und mindestens dreimal an verschiedenen Tagen durchgeführt.

Die RNA-Isolierung und die qRT-PCR wurden wie zuvor beschrieben36 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, zur Vorbereitung der RNA-Isolierung wurden flache 10-cm2-Gewebekulturröhrchen mit 2,5 ml NTHI bei 2 × 105 KBE/ml ausgesät. Nach 16-stündiger Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2 und feuchter Atmosphäre wurden die Röhrchen vorsichtig gewaschen, wie oben ausführlich beschrieben. Gewebekulturröhrchen wurden mit 5 µg MsTipMab pro 0,8 cm2 behandelt. Die Röhrchen wurden in den Inkubator zurückgebracht, vorsichtig umgedreht, sodass das Medium den Biofilm bedeckte, und bei 37 °C, 5 % CO2 für 2 oder 6 Stunden inkubieren gelassen. Nach 2 Stunden oder 6 Stunden wurden die Röhrchen umgedreht und das α-DNABII NTHI NRel („2 h NRel“ bzw. „6 h NRel“) durch Eingießen in separate Eppendorf-Röhrchen gesammelt. α-DNABII NTHI NRel wurden 1 m lang bei 16.000 × g und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und dann 1 ml TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 15-596-026) zu den Bakterienpellets gegeben. Suspendierte Bakterienlösungen wurden in separate Phasemaker-Röhrchen (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. A33248) überführt, die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt und die RNA mit einem Qiagen RNeasy-Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 74106) gereinigt. Restliche DNA wurde durch Behandlung mit DNase I (NEB, Kat.-Nr. M0303L) und SUPERase In RNase Inhibitor (Ambion, Kat.-Nr. AM2694) gemäß den Anweisungen des Herstellers für 45 m bei 37 °C entfernt. Die DNase I-Behandlung wurde wiederholt. qRT-PCR wurde mit dem SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Kat.-Nr. 11736059) durchgeführt und fache Änderungen der Genexpression über die ΔΔCt-Methode berechnet. Die für die qRT-PCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Experimente wurden mindestens dreimal mit 2–3 technischen Wiederholungen pro Assay und an verschiedenen Tagen durchgeführt.

Menschliche Neutrophile wurden mittels magnetischer Negativselektion mit dem EasySep Human Neutrophil Isolation Kit (StemCell Technologies, Inc., Kat.-Nr. 17957) aus Blut isoliert. Die Anfälligkeit von NTHI für die Abtötung durch menschliche Neutrophile wurde mit einigen Modifikationen wie zuvor beschrieben74 beurteilt. 1 × 106 Neutrophile wurden in 1 ml DPBS in einer nicht mit Gewebekultur behandelten Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Neutrophile wurden durch Zugabe von 50 nM Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. P8139) für 10 m bei 37 °C, 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre aktiviert. NRel wurden wie zuvor beschrieben nach 2 oder 6 Stunden aus Gewebekulturröhrchen gesammelt. Alle Bakteriensuspensionen wurden 2 m lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt, um etwaige Aggregate aufzubrechen, und dann so verdünnt, dass ein Bereich von 4,0 × 103–2,5 × 105 KBE NTHI/1 ml DPBS pro Vertiefung in der 24-Well-Testplatte hinzugefügt wurde . Für Experimente, bei denen der intrazelluläre NADPH-Oxidase-Inhibitor Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. D2926) verwendet wurde, wurden 0,05 µM DPI zu nicht aktivierten Neutrophilen gegeben und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur und dann 50 Sekunden lang inkubiert nM PMA hinzugefügt, um Neutrophile zu aktivieren, wie oben51,74. Unabhängig davon, ob Neutrophile mit DPI, Plankton oder α-DNABII NTHI NRel vorbehandelt wurden oder nicht, wurden aktivierte Neutrophile 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Nach 30 Minuten wurden 100 µL 10 × TrypLE (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. A1217701) in jede Vertiefung gegeben, kräftig pipettiert, verdünnt und zur Zählung auf Schokoladenagar ausplattiert. Die Experimente wurden mit 2–3 technischen Dreifachversuchen pro Assay an einzelnen Tagen für mindestens sechs separate Tage durchgeführt.

Planktonisch gewachsene und α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 oder MRSA NRel wurden mithilfe des fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen, Kat.-Nr. S7020)75 auf relative Membranpermeabilitäten untersucht ,76. Planktonisch gewachsene Bakterien in der mittleren Log-Phase wurden wie folgt hergestellt. NTHI von einer Schokoladenagarplatte, E. coli UTI89 von einer LB-Agarplatte oder P. aeruginosa 142-1- oder MRSA-Kolonien von einer TSA-Platte wurden separat in 1,5 ml äquilibriertem Medium auf OD490 0,10 suspendiert und dann statisch wachsen gelassen 3 h (für NTHI oder MRSA) oder 2,5 h (für E. coli UTI89 oder P. aeruginosa 142-1) mit belüfteter Kappe bei 37 °C und 5 % CO2. Nach der Inkubation wurde die OD490 der planktonisch gewachsenen Kultur abgelesen. Alle Bakteriensuspensionen wurden 3 Minuten lang bei 4 ° C mit 14.000 U / min zentrifugiert. Planktonisch gewachsene Bakterien wurden dann in 900 µL DPBS resuspendiert. α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 oder MRSA NRel wurden in 1,2 ml DPBS resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde für α-DNABII NRel bis zu zwei weitere Male wiederholt, um jegliche Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren.

Für 2 Stunden wurden die Bakterien von α-DNABII NTHI, E. coli UTI89, P. aeruginosa 142-1 oder MRSA NRel in einem Endvolumen von 900 µL DPBS resuspendiert. 6 h α-DNABII NTHI NRel wurden in einem Endvolumen von 500 µL DPBS resuspendiert. 6-stündige NRel wurden in einem geringeren DPBS-Volumen resuspendiert, da die KBE/ml der gesammelten Bakterien nach 6-stündiger Biofilm-Exposition gegenüber α-DNABII geringer waren als nach 2 Stunden. Alle Bakteriensuspensionen wurden 2 m lang sanft in einem Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt, um Bakterienaggregate aufzubrechen. 100-µL-Aliquote jeder Bakteriensuspension wurden zusammen mit 0,5 µM SYTOX Green oder 0,5 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. T8787) plus 0,5 µM SYTOX Green für NTHI und MRSA und 5 µM SYTOX Green oder 5 µM SYTOX Green plus 0,5 % Triton X-100 (Endkonzentrationen) für E. coli UTI89 und P. aeruginosa 142-1. Die Verwendung einer höheren Konzentration von SYTOX Green bei E. coli UTI89 und P. aeruginosa 142-1 war notwendig, da größere Genomgrößen (im Vergleich zu MRSA oder NTHI) eine höhere Konzentration von SYTOX Green erfordern, um die Interkalation über das größere Genom zu maximieren und die Linearität beizubehalten Bereich der Fluoreszenz77,78. Jede Bakteriensuspension wurde in die jeweiligen Vertiefungen gegeben, so dass ein Bereich von 2 bis 4 × 107 KBE aller jeweiligen Krankheitserreger/Vertiefung erreicht wurde. Die Experimente wurden mindestens dreimal an verschiedenen Tagen mit drei technischen Dreifachversuchen pro Test durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde spektrophotometrisch (bei einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 522 nm) alle 15 m für 120 m bei 37 °C mit dem Mikroplattenlesegerät FLUOstar Omega (BMG LABTECH, Ortenberg, Deutschland) gemessen.

Die statistische Signifikanz wurde mit GraphPad Prism Version 9 durch den ungepaarten zweiseitigen t-Test von Student zum Vergleich der Mittelwerte zwischen zwei Gruppen, durch die Zwei-Wege-ANOVA mit Šidák-Korrektur oder durch Mixed-Effects-Analyse zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen oder durch wiederholte lineare Messungen bestimmt gemischtes Modell zum Vergleich von Zeitverlaufsdaten. Eine Beschreibung der verwendeten statistischen Analyse finden Sie in den Abbildungslegenden. Alle In-vitro-Tests wurden mindestens dreimal an verschiedenen Tagen wiederholt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wird durch * angezeigt, ein p-Wert von ≤ 0,01 wird durch ** angezeigt, ein p-Wert von ≤ 0,001 wird durch *** angezeigt und ein p-Wert ≤ 0,0001 wird durch ** angezeigt **.

Die für die aktuelle Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Jennifer Neelans für ihre Unterstützung bei der Manuskripterstellung. Wir danken Christian Ahearn, PhD, für die durchdachten Diskussionen und die Unterstützung bei der Methodik des Membranpermeabilitätstests. Wir danken außerdem der Biostatistics Resource am Nationwide Children's Hospital (BRANCH) und dem Center for Biostatistics der Ohio State University für ihre Unterstützung beim Assay-Design und der Durchführung geeigneter statistischer Analysen. Abschließend möchten wir uns bei den Personen bedanken, die über den Blutspendedienst des Abigail Wexner Research Institute des Nationwide Children's Hospital Blut gespendet haben.

Diese Arbeit wurde vom NIH finanziert (R01DC011818 für LOB und SDG und R01DC003915 für LOB). Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Zentrum für mikrobielle Pathogenese, Abigail Wexner Research Institute am Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH, 43205, USA

Kathryn Q. Wilbanks, Elaine M. Mokrzan, Theresa M. Kesler, Nikola Kurbatfinski, Steven D. Goodman und Lauren O. Bakaletz

Abteilung für Pädiatrie, The Ohio State University College of Medicine, Columbus, OH, 43205, USA

Steven D. Goodman und Lauren O. Bakaletz

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Konzeptualisierung: EMM, SDG, LOB; Datenkuration: KQW, EMM, TMK, NK; Formale Analyse: KQW, EMM, TMK, NK; Fördermittelakquise: SDG, LOB; Untersuchung: KQW, EMM, TMK, NK; Methodik: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Projektverwaltung: SDG, LOB; Ressourcen: SDG, LOB; Aufsicht: SDG, LOB; Validierung: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Visualisierung: KQW, EMM, TMK, NK, SDG, LOB; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: KQW, LOB; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: KQW, EMM, TM.K., NK, SDG, LOB

Korrespondenz mit Lauren O. Bakaletz.

LOB und SDG sind Erfinder von Technologien und halten Patente im Zusammenhang mit dem DNABII-gesteuerten Ansatz, deren Rechte an Clarametyx Biosciences, Inc. lizenziert wurden. LOB und SDG sind wissenschaftliche Gründer und Co-Vorsitzende des wissenschaftlichen Beirats von Clarametyx Biosciences, Inc. KQW , EMM, TMK und NK erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wilbanks, KQ, Mokrzan, EM, Kesler, TM et al. Nicht typisierbare Haemophilus influenzae, die durch monoklonale Antikörper, die gegen eine Biofilmmatrixkomponente gerichtet sind, aus der Biofilmresidenz freigesetzt werden, weisen einen anfälligen Phänotyp auf. Sci Rep 13, 12959 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40284-5

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Eingegangen: 14. April 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40284-5

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