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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13539 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Trichosporon asahii ist ein opportunistischer pathogener Pilz, der bei immungeschwächten Patienten schwere und manchmal tödliche Infektionen verursacht. Hog1, eine mitogenaktivierte Proteinkinase, reguliert die Stressresistenz einiger pathogener Pilze, ihre Rolle bei T. asahii wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass die T. asahii-Mutante mit hog1-Genmangel empfindlich auf hohe Temperaturen, Zellmembranstress, oxidativen Stress und Antimykotika reagiert. Das Wachstum des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten war bei 40 °C verzögert. Der hog1-Gen-defiziente T. asahii-Mutant zeigte unter glukosereichen Bedingungen auch eine Empfindlichkeit gegenüber Natriumdodecylsulfat, Wasserstoffperoxid, Menadion, Methylmethansulfonat, UV-Exposition und Antimykotika wie Amphotericin B. Unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung zeigte der hog1-Gen-defiziente Mutant eine Empfindlichkeit gegenüber NaCl und KCl. Die Virulenz des hog1-Gen-defizienten Mutanten gegen Seidenraupen wurde abgeschwächt. Darüber hinaus verringerte sich die Lebensfähigkeit des hog1-Gen-defizienten Mutanten in der Seidenraupen-Hämolymphe. Diese Phänotypen wurden durch die erneute Einführung des hog1-Gens in den Mutanten mit Gendefizienz wiederhergestellt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Hog1 eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zellulärer Stressreaktionen in T. asahii spielt.

Der pathogene Pilz Trichosporon asahii ist ein Basidiomyceten-Hefepilz, der häufig aus Erde, menschlichem Blut, Sputum, Haut, Kot und Urin isoliert wird1,2,3,4,5,6. T. asahii verursacht bei immungeschwächten Patienten schwere Pilzinfektionen7,8 und die Sterblichkeitsrate tiefer Mykosen durch T. asahii ist höher als die von Infektionen durch Candida albicans, einen anderen pathogenen Pilz (80 % gegenüber 40 %9). Micafungin, ein Echinocandin-Antimykotikum, wird zur Behandlung von Patienten mit Verdacht auf Pilzinfektionen eingesetzt. Wenn Infektionen durch T. asahii verursacht werden, kommt es zu schweren Infektionen, da T. asahii gegenüber Micafungin tolerant ist10,11. Auch Amphotericin B- und Azol-resistente T. asahii-Stämme wurden aus Patienten isoliert12,13. Daher sind durch T. asahii verursachte Infektionen im klinischen Umfeld problematisch8.

Der Hog1-vermittelte Signalweg ist an der Resistenz von Pilzen gegen verschiedene Arten von Stressfaktoren beteiligt14,15,16. Das Hog1-Protein, eine Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), wandert als Reaktion auf Umweltstress vom Zytoplasma in den Zellkern und reguliert in Verbindung mit mehreren Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen, die mit der Stressresistenz zusammenhängen15,16. Hog1-vermittelte Stressresistenz und Genregulation beeinflussen auch die Virulenz des pathogenen Pilzes Cryptococcus neoformans17,18,19. Das Hog1-Protein ist auch an der Pathogenität von C. albicans gegenüber dem Wirt beteiligt, indem es seine Resistenz gegenüber verschiedenen Stressfaktoren erhöht und die morphologische Veränderung von Hefe zu Myzel kontrolliert20,21,22,23,24. Darüber hinaus hängen Stressreaktionssysteme mit morphologischen Veränderungen bei C. albicans zusammen25,26,27,28. Die Rolle von Hog1 bei der Stresstoleranz und Virulenz von T. asahii bleibt jedoch unbekannt.

Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die der Virulenz von T. asahii zugrunde liegen, wurden ein Seidenraupeninfektionsmodell und eine Methode zur Konstruktion einer gendefizienten T. asahii-Mutante etabliert29,30. Die Verwendung eines wirbellosen Seidenraupenmodells für Infektionsexperimente ist äußerst vorteilhaft, da die Aufzucht von Seidenraupen in großer Zahl weniger kostspielig ist und mit ihrer Verwendung weniger ethische Probleme verbunden sind31,32. Die Virulenz klinischer Isolate von T. asahii kann quantitativ bewertet werden, indem die halbmaximale tödliche Dosis (LD50) berechnet wird. Dabei handelt es sich um die Dosis eines Krankheitserregers, die erforderlich ist, um die Hälfte der Tiere in einer Gruppe zu töten29. Ein effizientes Gen-Targeting-System wurde entwickelt, um gendefiziente Mutanten von T. asahii30,33 zu erzeugen. Gendefiziente T. asahii-Mutanten von Calcineurin, einer Calcium-Calmodulin-aktivierten Phosphatase, weisen eine verringerte Virulenz gegen Seidenraupen auf34. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Bewertungssystem, das ein Seidenraupeninfektionsmodell und ein Genmanipulationssystem umfasst, zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der T. asahii-Infektion nützlich ist.

In der vorliegenden Studie haben wir eine T. asahii-Mutante mit hog1-Gen-Defizienz erzeugt und die Phänotypen im Zusammenhang mit Stressresistenz und Virulenz in einem Seidenraupeninfektionsmodell charakterisiert. Der hog1-Gen-defiziente Mutant zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie Membranschäden verursachen, und gegenüber Antimykotika. Darüber hinaus nahm die Virulenz des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten gegen Seidenraupen ab. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Virulenz und die zellulären Stressreaktionen von T. asahii durch den Hog1-vermittelten Signalweg gesteuert werden.

Wir führten eine Aminosäuresequenz-Homologieanalyse mit dem Hog1-Protein von T. asahii durch, basierend auf Genominformationen eines repräsentativen Modellpilzes, Saccharomyces cerevisiae, und repräsentativer pathogener Pilze, Aspergillus fumigatus, C. neoformans und C. albicans. Die Aminosäuresequenz des Hog1-Proteins von T. asahii war zu mehr als 70 % identisch mit der dieser Pilze (Abb. 1a und Ergänzungstabelle S1). Das Hog1-Protein von T. asahii enthält eine Proteinkinase-C-ähnliche Superfamiliendomäne, die eine ATP-Bindungsstelle, eine Polypeptidsubstrat-Bindungsstelle und eine Aktivierungsschleife umfasst (Abb. 1b, c und Ergänzungstabelle S2).

Schätzung des Hog1-Proteins in T. asahii und Konservierung der Aminosäuren bei typischen Pilzen. (a) Der phylogenetische Baum von T. asahii, C. neoformans, S. cerevisiae, C. albicans Hog1 und A. fumigatus SakA wurde gemäß der Maximum-Likelihood-Methode erstellt. (b) Schätzung der funktionellen Domäne von T. asahii Hog1 und Homologen. (c) Konservierung der Aminosäuren der Proteinkinase-C-ähnlichen Superfamiliendomäne in T. asahii Hog1. Die ATP-Bindungsstelle, die Polypeptidsubstrat-Bindungsstelle und die Aktivierungsschleife (A-Schleife) sind jeweils durch rote, grüne und blaue Linien gekennzeichnet.

Der ku70-Gen-defiziente Stamm von T. asahii MPU129 weist eine hohe homologe Rekombinationseffizienz auf, was ihn als Elternstamm nützlich macht30. Mit diesem Stamm erzeugten wir den hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten. Das Targeting-DNA-Fragment, das zur Erzeugung der hog1-Gen-defizienten Mutante verwendet wurde, enthält das NAT1-Gen, das zur Nourseothricin-Resistenz führt (Abb. 2a). Transformanten mit Nourseothricin-Resistenz wurden durch Einführung des DNA-Fragments durch Elektroporation erhalten (Abb. 2b). Genomische DNA wurde aus den Transformanten extrahiert und der Ersatz des hog1-Gens wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bestätigt (Abb. 2c, d). Sekundäre genetische Mutationen wie Punktmutationen können bei der Erzeugung gendefizienter Mutanten auftreten. Daher haben wir auch einen revertanten Stamm der hog1-Gen-defizienten Mutante erzeugt, um zu bestätigen, dass der Phänotyp des gendefizienten Stamms auf einen Mangel des Zielgens zurückzuführen ist. Das Targeting-DNA-Fragment, das zur Erzeugung des Revertantenstamms des hog1-Gen-defizienten Mutanten verwendet wird, enthält das hph-Gen, das zur Hygromycin-B-Resistenz führt (Abb. 2a). Transformanten mit Hygromycin B-Resistenz wurden durch Einführung des DNA-Fragments durch Elektroporation erhalten (Abb. 2b). Die Wiedereinführung des hog1-Gens wurde durch PCR unter Verwendung von aus den Transformanten extrahierter DNA verifiziert (Abb. 2c, d). Diese Ergebnisse bestätigten die Entstehung des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten und des mit dem hog1-Gen wiedereingeführten Revertanten.

Erzeugung der hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutante und ihrer Revertante. (a–d) Erzeugung des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten und seines Revertanten. (a) Strategie zur Erzeugung des hog1-Gen-defizienten Mutanten (∆hog1) und seines Revertanten (Rev.). Gezeigt werden die vorhergesagten Genome der hog1-Gen-defizienten Mutante und ihrer Revertante. (b) Der Elternstamm (Parent), die hog1-Gen-defiziente Mutante (∆hog1) und ihre Revertante (Rev.) wurden auf SDA mit Nourseothricin (Nou) (100 µg/ml) oder Hygromycin B (Hyg) (100) verteilt µg/ml) und 2 Tage bei 27 °C inkubiert. (c) Position der Primer zur Bestätigung der Genomstruktur des hog1-Gen-defizienten Kandidaten durch PCR unter Verwendung extrahierter Genom-DNA. (d) Bestätigung der Genotypen des hog1-Gen-defizienten Mutanten (∆hog1) und seines Revertanten (Rev.) durch PCR unter Verwendung extrahierter Genom-DNA. Es wurden abgeschnittene Blots verwendet. Blots in voller Länge sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Bei C. neoformans und S. cerevisiae ist das Wachstum von Stämmen mit hog1-Gen-Mangel bei 39–40 °C im Vergleich zu ihren jeweiligen Eltern verzögert14,17,35. Wir untersuchten, ob Hog1 an der Hochtemperaturresistenz von T. asahii beteiligt ist. Das Wachstum des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten war bei 40 °C verzögert (Abb. 3). Andererseits kam es bei 27 °C oder 37 °C zu keiner Wachstumsverzögerung des hog1-Gen-defizienten Mutanten (Abb. 3). Der hochtemperaturempfindliche Phänotyp der hog1-Gen-defizienten Mutanten wurde im Revertantenstamm unterdrückt (Abb. 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der hog1-Gen-defiziente T. asahii-Mutant empfindlich auf Hochtemperaturstress reagiert.

Temperaturempfindlichkeit des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten. (a) Der T. asahii-Elternstamm (Parent), der hog1-Gen-defiziente Mutant (∆hog1) und der Revertant von ∆hog1 (Rev.) wurden auf SDA gezüchtet und 1 Tag bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert. Mit Kochsalzlösung wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf den SDA aufgetragen. Agarplatten wurden 24 Stunden lang bei 27 °C, 37 °C oder 40 °C inkubiert. (b) Der T. asahii-Elternstamm (Parent), der hog1-Gen-defiziente Mutant (∆hog1) und der Revertant von ∆hog1 (Rev.) wurden auf Sabouraud-Medium geimpft und bei 27 °C, 37 °C, oder 40 °C. Die Absorption der Kultur bei 630 nm wurde überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angezeigt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe des Tukey-Tests bewertet. *P < 0,05.

Als nächstes untersuchten wir, ob Hog1 zur Toleranz gegenüber mehreren Stressfaktoren bei T. asahii beiträgt. NaCl, KCl und Sorbit verursachen osmotischen Stress20,21,22,23,24,36,37. Natriumdodecylsulfat (SDS) schädigt die Zellmembran35,38,39,40. Kongorot und Koffein verursachen Zellwandschäden38,40. Wasserstoffperoxid (H2O2) induziert oxidativen Stress17,19,20,23,41,42. Tunicamycin (TM) und Dithiothreitol (DTT) induzieren Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER)24,35,43. UV-Strahlung und Methylmethansulfonat (MMS) verursachen DNA-Schäden17,35,44. Die Anzahl toleranter Zellen im hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten war auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA), der SDS, H2O2, Menadion, MMS enthielt, oder bei UV-Exposition verringert, jedoch nicht auf SDA, der NaCl, KCl, Sorbit und Koffein enthielt , Kongorot, TM oder DTT (Abb. 4a–e).

Empfindlichkeit des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten gegenüber Stressoren. (a–f) Der T. asahii-Elternstamm (Parent), der hog1-Gen-defiziente Mutant (∆hog1) und der Revertant von ∆hog1 (Rev.) wurden auf SDA gezüchtet und 1 Tag bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Mit Kochsalzlösung wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf das SDA getupft, das NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), Sorbit (2 M), SDS (0,008 %), Koffein (0,65 mg/ml) und Kongorot (400 µg/ml) enthielt. mL), H2O2 (3 mM), Menadion (60 µM), Tunicamycin (TM, 1 µg/mL), Dithiothreitol (DTT, 12 mM), Methylmethansulfonat (MMS, 0,05 %), Amphotericin-B (AMPH-B, 0,4 µg/ml), Fluconazol (18 µg/ml) und Voriconazol (VRCZ, 0,2 µg/ml). Zellen auf SDA wurden UV-Strahlung (400 J/m2) ausgesetzt. Jede Agarplatte von (a–d) oder (f) wurde 24 bzw. 48 Stunden bei 27 °C inkubiert.

Amphotericin B und Fluconazol werden zur Behandlung von T. asahii-Infektionen eingesetzt45,46. Die hog1-Gen-defizienten Mutanten von C. neoformans und C. albicans reagieren empfindlich auf ein Antimykotikum, das Amphotericin B (AMPH-B)19,23,38,42. Der hog1-Gen-defiziente Mutant von C. albicans ist anfällig für Azol-Antimykotika, wohingegen der hog1-Gen-defiziente Mutant von C. neoformans resistent ist19,23,38,42. Die Anzahl toleranter Zellen im hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten war bei SDA, das AMPH-B, Fluconazol (FLCZ) oder Voriconazol (VRCZ) enthielt, verringert (Abb. 4f). Darüber hinaus haben wir die MHK-Werte von Antimykotika zur Hemmung des Wachstums des Elternstamms oder des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten bestimmt. Im Vergleich zum Elternstamm waren die MHK-Werte von AMPH-B, FLCZ, ITCZ ​​und VRCZ im hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten niedriger (Tabelle 1). Die Phänotypen der hog1-Gen-defizienten Mutante wurden in der Revertante unterdrückt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das hog1-Gen in T. asahii an der Resistenz gegen Zellmembranschäden, oxidativen Stress, DNA-Schäden und Antimykotika wie AMPH-B und Azol-Antimykotika beteiligt ist.

Der hog1-Gen-defiziente Mutant von T. asahii zeigte unter glukosereichen Bedingungen keine eindeutige Empfindlichkeit gegenüber KCl, NaCl, Sorbit, Koffein, Kongorot, TM oder DTT. Hog1 in C. neoformans spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Stressreaktionen unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung47. Daher untersuchten wir, ob ein hog1-Genmangel bei T. asahii unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung eine Empfindlichkeit gegenüber diesen Verbindungen verursacht. Unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung wurde das Wachstum des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten durch NaCl und KCl verzögert, nicht jedoch durch Sorbit, Koffein, Kongorot, TM oder DTT (Abb. 5). Die Phänotypen der NaCl- und KCl-Empfindlichkeit des hog1-Gen-defizienten Mutanten wurden im Revertanten unterdrückt (Abb. 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das hog1-Gen in T. asahii zum Stress beiträgt, der durch NaCl und KCl unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung verursacht wird.

Einfluss von Glukose auf die Empfindlichkeit der hog1-Gen-defizienten Mutanten gegenüber Stressoren. Der T. asahii-Elternstamm (Parent), der hog1-Gen-defiziente Mutant (∆hog1) und der Revertant von ∆hog1 (Rev.) wurden auf glukoselimitiertem Pepton-Agar gezüchtet und 1 Tag bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Mit Kochsalzlösung wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf den glukosereduzierten Pepton-Agar getupft, der NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), Sorbitol (2 M), Koffein (0,65 mg/ml) und Kongorot (400 µg/ml) enthielt. , Tunicamycin (TM, 1 µg/ml) oder Dithiothreitol (DTT, 8 mM). Jede Agarplatte wurde 48 Stunden lang bei 27 °C inkubiert.

T. asahii hat mehrere morphologische Formen, darunter Hefe, Hyphen (Filamentform) und Arthrokonidien (Zellketten und asexuelle Sporen)4. In C. albicans ist Hog1 ein Schlüsselfaktor, der die Hyphenbildung reguliert20,21,23,25,26,27,28,48. Wir untersuchten, ob ein hog1-Genmangel die Hyphenbildung bei T. asahii beeinflusst. Im Sabouraud-Dextrose-Medium war das Hyphenverhältnis in der Mutante mit hog1-Gen-Mangel höher als im Elternstamm (Abb. 6). Andererseits war das Hefe- und Arthrokonidien-Verhältnis im hog1-Gen-defizienten Mutanten niedriger als im Elternstamm (Abb. 6). Die Hyphen-pro-Hefe-Verhältnisse im Elternstamm und im hog1-Gen-defizienten Mutanten betrugen 0,3 bzw. 2,3. Der Phänotyp einer höheren Hyphenbildungsaktivität im hog1-Gen-defizienten Mutanten wurde im Revertanten unterdrückt (Abb. 6). Diese Beobachtungen legen nahe, dass das hog1-Gen die Hyphenbildung durch T. asahii reguliert.

Auswirkung des hog1-Gen-Mangels auf die Morphologie von T. asahii im Sabouraud-Dextrose-Medium. Der T. asahii-Elternstamm (Parent), die hog1-Gen-defiziente Mutante (∆hog1) und die Revertante von ∆hog1 (Rev.) wurden auf SDA gezüchtet und 2 Tage lang bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert. Die Absorption der T. asahii-Zellsuspension bei 630 nm wurde auf 1 eingestellt. Die Zellsuspension (10 µL) wurde zu Sabouraud-Dextrose-Medium (100 µL) gegeben. Die Lösungen wurden 48 Stunden lang bei 27 °C inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde auf Glasobjektträger gegeben und mit Glasdeckgläsern abgedeckt. (a) Die Proben wurden mit hellem Licht unter einem Mikroskop untersucht. Maßstabsbalken, 20 µm. (b) Die Bilder wurden zufällig erhalten. Die Anzahl von drei Zelltypen: Hefe, Arthroconidia und Hyphen, wurde gezählt.

Wir untersuchten, ob ein Mangel des hog1-Gens die Virulenz von T. asahii gegen Seidenraupen verringert. Die Überlebenszeit von Seidenraupen, denen der hog1-Gen-defiziente Mutant injiziert wurde, war länger als die des Elternstamms (Abb. 7a). Der LD50-Wert des hog1-Gen-defizienten Mutanten war zehnmal höher als der des Elternstamms (Abb. 7b und Tabelle 2). Dieser Phänotyp wurde im Revertanten unterdrückt (Abb. 7 und Tabelle 2). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das hog1-Gen an der Virulenz von T. asahii gegen Seidenraupen beteiligt ist.

Abgeschwächte Virulenz des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten gegen Seidenraupen. (a) Der T. asahii-Elternstamm (Elternstamm; 1,3 × 103 Zellen/Larve), der hog1-Gen-defiziente Mutant (∆hog1; 1,6 × 103 Zellen/Larve) und der Revertant von ∆hog1 (Rev.; 1,1 × 103 Zellen/Larve) wurden in die Hämolymphe der Seidenraupe injiziert und die Seidenraupen wurden bei 37 °C inkubiert. Das Überleben der Seidenraupen wurde 96 Stunden lang überwacht. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen der Elternstammgruppe und der Mutantengruppe mit hog1-Gen-Mangel wurde durch den Log-Rank-Test basierend auf den Kurven nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. n = 10/Gruppe. (b) Die Anzahl der überlebenden Seidenraupen bei 37 °C wurde 72 Stunden nach der Verabreichung der Pilzzellen (1 × 102 bis 5,5 × 104 Zellen/Larve) in die Hämolymphe der Seidenraupe bestimmt. Überlebende und tote Seidenraupen werden mit 1 bzw. 0 angegeben. n = 4/Gruppe. Kurven wurden aus kombinierten Daten von zwei unabhängigen Experimenten mit einem einfachen logistischen Regressionsmodell erstellt. Das Ergebnis der halbmaximalen Letalzeit (LT50), also der Zeit, die erforderlich ist, um die Hälfte der Tiere in einer Gruppe zu töten, ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt.

Wir untersuchten die Auswirkung eines hog1-Genmangels auf die Lebensfähigkeit von T. asahii-Zellen in geernteter Seidenraupen-Hämolymphe in vitro. Beim Elternstamm stieg die Anzahl lebensfähiger Zellen in der Hämolymphe der Seidenraupe nach der Inkubation (Abb. 8a). Andererseits nahm die Anzahl lebensfähiger Zellen der Mutante mit hog1-Genmangel in der Seidenraupenhämolymphe nach 96-stündiger Inkubation ab (Abb. 8a). Die Anzahl lebensfähiger Zellen des hog1-Gen-defizienten Mutanten in der Seidenraupenhämolymphe war nach 96-stündiger Inkubation niedriger als die des Elternstamms (Abb. 8b). In der Hämolymphe der Seidenraupe war das Hyphenverhältnis in der Mutante mit hog1-Gen-Mangel höher als im Elternstamm (Abb. 9). Die Phänotypen einer höheren hyphenbildenden Aktivität im hog1-Gen-defizienten Mutanten wurden im Revertanten unterdrückt (Abb. 8 und 9). Diese Beobachtung legt nahe, dass das hog1-Gen an den morphologischen Veränderungen von T. asahii in der Seidenraupen-Hämolymphe und der Toleranz gegenüber den Faktoren in der Seidenraupen-Hämolymphe beteiligt ist.

Abnahme der Anzahl lebensfähiger Zellen des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten in geernteter Seidenraupen-Hämolymphe. Der T. asahii-Elternstamm (Parent), die hog1-Gen-defiziente Mutante (∆hog1) und die Revertante von ∆hog1 (Rev.) wurden auf SDA gezüchtet und 1 Tag bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert. Die Absorption der T. asahii-Zellsuspension bei 630 nm wurde auf 1–1,5 eingestellt. Die Zellsuspension (10 µL) wurde zu geernteter Seidenraupenhämolymphe (90 µL) gegeben und die Lösungen wurden 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Die lebensfähigen Zellen von T. asahii wurden mit der CFU-Methode bestimmt. (a) Zeitverlaufsexperiment. n = 3/Gruppe. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen 0 und 4 Tagen wurden mithilfe des Student-T-Tests ausgewertet. *P < 0,05. (b) Die lebensfähigen Zellen von T. asahii wurden 4 Tage nach der Inokulation bestimmt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe des Tukey-Tests bewertet. *P < 0,05.

Rolle des hog1-Gens bei der morphologischen Veränderung von T. asahii in der Seidenraupen-Hämolymphe. Der T. asahii-Elternstamm (Parent), die hog1-Gen-defiziente Mutante (∆hog1) und die Revertante von ∆hog1 (Rev.) wurden auf SDA gezüchtet und 2 Tage lang bei 27 °C inkubiert. T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert. Die Absorption der T. asahii-Zellsuspension bei 630 nm wurde auf 1 eingestellt. Die Zellsuspension (10 µL) wurde zu Hämolymphe (100 µL) gegeben. Die Lösungen wurden 48 Stunden lang bei 27 °C inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde auf Glasobjektträger gegeben und mit Glasdeckgläsern abgedeckt. (a) Die Proben wurden mit hellem Licht unter einem Mikroskop untersucht. Maßstabsbalken, 20 µm. (b) Die Bilder wurden zufällig erhalten. Die Anzahl von drei Zelltypen: Hefe, Arthroconidia und Hyphen, wurde gezählt.

In der vorliegenden Studie haben wir eine T. asahii-Mutante mit hog1-Gen-Mangel erzeugt, um die Rolle des hog1-Gens für Stresstoleranz und Virulenz zu untersuchen. Das hog1-Gen in T. asahii spielt eine entscheidende Rolle bei der Stresstoleranz gegenüber hohen Temperaturen, Oxidationsmitteln, Antimykotika und Faktoren in der Seidenraupen-Hämolymphe. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Stresstoleranz von T. asahii durch den Hog1-vermittelten Signalweg reguliert wird und dass die Stresstoleranz von T. asahii zu seiner Virulenz beitragen könnte.

Hog1 ist ein MAPK, das in Pilzen weit verbreitet ist16,49. Bei Pilzen wie S. cerevisiae und C. neoformans ist der Hog1-vermittelte Signalweg an der Resistenz gegen verschiedene Stressfaktoren beteiligt15,16. Im Genom von T. asahii wurde ein Gen identifiziert, das ein Protein mit mehr als 70 % Homologie zur Aminosäuresequenz von Hog1 in S. cerevisiae und C. neoformans kodiert. Darüber hinaus enthält das Hog1-Protein in T. asahii eine Phosphorylierungsdomäne. Daher gingen wir davon aus, dass Hog1 auch an der Kinasekaskade im Zusammenhang mit den Stressreaktionen in T. asahii beteiligt ist.

Das hog1-Gen ist für das normale Wachstum von T. asahii unter Hochtemperaturbedingungen (40 °C) erforderlich. Eine starke Wachstumshemmung des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten wurde bei 40 °C im Vergleich zu 27 °C und 37 °C beobachtet. Daher wird die Hochtemperatur-Stressreaktion in T. asahii durch Hog1 vermittelt. Bei C. neoformans und S. cerevisiae ist der Hog1-vermittelte Signalweg für das Wachstum bei 40 °C erforderlich14,17,35. S. cerevisiae Hog1 wird durch hohe Temperaturen aktiviert und ist für die sofortige Erholung von hohen Temperaturen erforderlich14. Darüber hinaus aktiviert Hochtemperaturstress gleichzeitig Hog1 und den Zellwandintegritätsweg in S. cerevisiae50. In Candida albicans reguliert Hog1 den Zellwandintegritätsweg51. Die Deletion des CEL1-Gens, das eine lytische Polysaccharid-Monooxygenase kodiert, die an der Zellwandintegrität in Cryptococcus neoformans beteiligt ist, führt zu einer Anfälligkeit für hohen Temperaturstress52. Daher gingen wir davon aus, dass Hog1 in T. asahii möglicherweise durch Hochtemperaturstress aktiviert wird und den Zellwandintegritätspfad für die Toleranz gegenüber Hochtemperaturstress reguliert.

Hog1 wird für verschiedene Arten von Stressreaktionen bei T. asahii benötigt. Hog1 in S. cerevisiae und C. albicans sowie SakA in A. fumigatus spielen eine wichtige Rolle bei osmotischen Stressreaktionen20,21,22,23,24,36,37. In C. neoformans ist Hog1 für die Resistenz gegen Stress erforderlich, der durch NaCl und KCl unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung verursacht wird19,47. Bei T. asahii ist Hog1 unter glukosereichen Bedingungen nicht an osmotischen Stressreaktionen beteiligt. Andererseits hängt Hog1 in T. asahii mit einer Resistenz gegen NaCl und KCl unter einer glukoseeingeschränkten Bedingung zusammen. Die Phänotypen von T. asahii ähneln denen von C. neoformans. Vor dem Hog1-MAPK-Signalweg in S. cerevisiae befinden sich zwei Verzweigungskaskaden, bestehend aus Sho1 oder Sln1, die die Pbs2-MAPK-Kinase-Kinase phosphorylieren14,15. Das Gen, das für das Sln1-Homolog von S. cerevisiae kodiert, ist jedoch nicht im Genom von C. neoformans vorhanden, und die Histidinkinase Tco2 fungiert anstelle von Sln1 als osmotischer Sensor15,19,53. Die Histidinkinase in T. asahii weist eine Aminosäuresequenzhomologie von 46 % mit C. neoformans Tco2 auf. Darüber hinaus weist kein Protein in T. asahii mindestens 30 % Aminosäuresequenzhomologie mit dem osmotischen Sensor Sho1 in S. cerevisiae auf. Daher verfügt T. asahii möglicherweise über einen Tco2-vermittelten Reaktionsmechanismus auf osmotischen Stress, der dem von C. neoformans ähnelt. In C. neoformans exportiert Ena1, eine durch Hog1 regulierte Na+/ATPase, Kationen wie Natrium- und Kaliumionen47,54. Der ena1-Gen-defiziente C. neoformans-Mutant zeigt ein ähnliches Wachstum wie der Wildtyp-Stamm unter Stress, der durch NaCl und KCl unter glukosereichen Bedingungen induziert wird, zeigt jedoch unter glukosearmen Bedingungen eine Anfälligkeit47,54. In T. asahii kann Hog1 den durch Ena1 vermittelten Stresstoleranzmechanismus für Natrium- und Kaliumionen unter Bedingungen mit niedrigem Glucosespiegel regulieren. Weitere Studien sind erforderlich, um die Beziehungen zwischen Hog1 und Tco2 oder Ena1 bei der Kationenstressreaktion von T. asahii zu klären. Hog1 in C. neoformans und SakA, ein Homolog von Hog1, in A. fumigatus zeigen eine Anfälligkeit für Verbindungen, die Schäden an der Zellmembran verursachen35,39,40. SakA in A. fumigatus ist für den Signalweg der Zellwandintegrität erforderlich und trägt zur Resistenz gegen Zellwandschäden bei39. Da andererseits der Hog1-Signalweg und der Signalweg für die Zellwandintegrität bei C. neoformans nicht miteinander verbunden sind, zeigt der hog1-Gen-defiziente Mutant keine ausgeprägte Anfälligkeit für Zellwandstress38,40. Bei T. asahii trägt Hog1 zur Toleranz gegenüber Zellmembranschäden bei, jedoch nicht zur Zellwandschädigung. Daher ist die Funktion von Hog1 in T. asahii für die Aufrechterhaltung von Zellmembranen und Zellwänden ähnlich der in C. neoformans. In C. neoformans, C. albicans und S. cerevisiae spielt Hog1 eine entscheidende Rolle bei der Resistenz gegen oxidativen Stress und ER-Stress17,20,23,24,35,41,42,43. Der hog1-Gen-defiziente T. asahii-Mutant zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress, jedoch nicht gegenüber ER-Stress. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Hog1 in T. asahii ein wesentlicher Faktor für die Resistenz gegen oxidativen Stress ist und dass T. asahii über einen Mechanismus verfügt, der eine Hog1-vermittelte Resistenz gegen oxidativen Stress beinhaltet, ähnlich wie bei anderen Pilzen wie C. neoformans. Hog1 in C. neoformans reguliert die Expression von oxidativen Stressfaktoren wie Katalase und mitochondrialer Mangansuperoxiddismutase54. Die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber H2O2 und Menadion, die bei der T. asahii-Mutante mit hog1-Gen-Mangel beobachtet wurde, kann auf eine Abnahme der Aktivität von Enzymen zurückzuführen sein, die an der Eliminierung reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind. Die Identifizierung der verantwortlichen Enzyme, die von Hog1 reguliert werden, um reaktive Sauerstoffspezies in T. asahii zu eliminieren, wird ein wichtiges zukünftiges Forschungsziel sein. Hog1 in C. neoformans und S. cerevisiae trägt zur Resistenz gegen DNA-Schäden bei17,35,44. Die Empfindlichkeit des hog1-Gen-defizienten T. asahii-Mutanten gegenüber MMS und UV legt nahe, dass Hog1 ein wesentlicher Faktor für die Resistenz gegen DNA-Mutationen in T. asahii ist. Wir gingen davon aus, dass Hog1 in T. asahii bei Einwirkung dieser Stressfaktoren phosphoryliert wird. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörpers gegen T. asahii Hog1 ist wichtig, um die Stressreaktionsmechanismen durch Phosphorylierung aufzudecken.

T. asahii weist eine Hog1-vermittelte Resistenz gegen Antimykotika auf. Der hog1-Gen-defiziente Mutant in C. albicans zeigt Empfindlichkeiten gegenüber AMPH-B und Azol-Antimykotika23. Bei C. neoformans zeigt der hog1-Gen-defiziente Mutant eine Empfindlichkeit gegenüber AMPH-B, jedoch nicht gegenüber Azol-Antimykotika19,35,38. Hog1 in T. asahii ist an der Resistenz gegen Antimykotika beteiligt. Die kombinierte Anwendung von Hog1-Inhibitoren und AMPH-B- oder Azol-Antimykotika könnte bei der Behandlung von T. asahii-Infektionen wirksam sein.

C. albicans weist zwei Formen von Hefen und Hyphen auf, und die Hyphenverlängerung wird durch Hog120,21,23,25,26,27,28,48 negativ reguliert. Da die T. asahii-Mutante mit hog1-Genmangel mehr Hyphen bildet als der Elternstamm, könnte Hog1 die Hyphenbildung in T. asahii regulieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass Hog1 in T. asahii die Expression von Genen steuert, die mit der Hyphenbildung zusammenhängen. Die Hyphenbildung bei T. asahii wird durch Magnesium induziert55. Bei C. albicans aktiviert Magnesiummangel Hog156. Daher spielt Magnesium eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Hog1-Aktivierung in Pilzen. In T. asahii kann Magnesium den Hog1-Signalweg unterdrücken und die Hyphenbildung fördern, die dem Phänotyp des hog1-Gen-defizienten Mutanten ähnelt. Die Identifizierung der wichtigen Gene, die an der durch Hog1 regulierten Hyphenbildung beteiligt sind, ist eine wichtige zukünftige Herausforderung zur Vertiefung unseres Verständnisses der morphologischen Aspekte von T. asahii.

Die Virulenz von T. asahii gegen Seidenraupen wurde durch den Mangel am hog1-Gen verringert. Darüber hinaus nahm die Anzahl lebensfähiger Zellen im hog1-Gen-defizienten Mutanten in der Seidenraupen-Hämolymphe ab. Wir spekulieren, dass ein hog1-Genmangel verschiedene Stressempfindlichkeiten in der Wirtsumgebung verursacht und zu einem virulenten Phänotyp bei T. asahii führt. Daher ist die Identifizierung von Wirtsfaktoren, die Hog1-vermittelte Stressreaktionen auslösen, ein wichtiges Thema für zukünftige Forschung.

Hog1-Inhibitoren können die Virulenz von T. asahii abschwächen. Diese Inhibitoren können jedoch Auswirkungen auf den Menschen haben, da Hog1 bei Eukaryoten hoch konserviert ist. Daher ist die Entwicklung pilzspezifischer Hog1-Inhibitoren erforderlich. In Calcineurin, das in Eukaryoten wie Hog1 hochkonserviert ist, wurde ein pilzspezifischer Calcineurin-Inhibitor synthetisiert, indem man sich auf die subtilen Strukturunterschiede zwischen menschlichem Calcineurin und Pilz-Calcineurin konzentrierte57. Wir gingen davon aus, dass es möglich sein könnte, basierend auf strukturellen Unterschieden selektive Hemmstoffe für Hog1 aus Pilzen zu konstruieren, ähnlich wie bei der Entwicklung von Hemmstoffen für Calcineurin.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass T. asahii die Stressreaktion und Virulenz über Hog1 steuert. Hog1-vermittelte Stressreaktionen könnten zur Resistenz gegen Antimykotika und zur Virulenz von T. asahii beitragen, indem sie dessen Anpassung an die Wirtsumgebung erleichtern. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hog1-Inhibitoren als Antiinfektiva in Kombination mit Antimykotika bei der Behandlung von T. asahii-Infektionen nützlich sein könnten.

Nourseothricin wurde von Jena Bioscience (Dortmund, Deutschland) bezogen. Cefotaxim-Natrium, D-Glucose, Agar, NaCl, KCl, Sorbitol, H2O2, DTT, MMS und AMPH-B wurden von Fujifilm Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) bezogen. Hygromycin B, Koffein, FLCZ, VRCZ und N-Phenylthioharnstoff wurden von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japan) bezogen. Kongorot und Menadion wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft. G418 wurde von Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA) gekauft. Hippolypepton wurde von Nihon Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japan) gekauft. Tunicamycin (TM) wurde von Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA) gekauft. Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde von Nippon Gene Co., Ltd. (Tokio, Japan) gekauft. Tween 80 wurde von MP Biomedicals LLC (Santa Ana, MO, USA) gekauft.

Die Aminosäuresequenzen der Hog1-Proteine ​​in T. asahii, C. neoformans, C. albicans und S. cerevisiae sowie des SakA-Proteins in A. fumigatus wurden von Ensembl Fungi (http://fungi.ensembl.org/index) erhalten .html). Die Ensembl Fungi-Gen-IDs der Proteine ​​sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die funktionellen Domänen der Proteine ​​wurden auf der NCBI-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) geschätzt. Die NCBI-Domänenzugangsnummern der Proteine ​​sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Der phylogenetische Baum wurde gemäß der Maximum-Likelihood-Methode unter Verwendung der MEGA11-Software (https://www.megasoftware.net/) erstellt. Das Aminosäuresequenz-Alignment wurde mit der MEGA11-Software durchgeführt.

Der in dieser Studie verwendete T. asahii-Stamm (MPU129 ku70-Gen-defizienter Mutant) wurde wie zuvor berichtet generiert30. Die T. asahii MPU129 ku70-Gen-defiziente Mutante wurde auf SDA (1 % Hipolypepton, 4 % Dextrose und 1,5 % Agar) mit G418 (100 μg/ml) gezüchtet und 2 Tage bei 27 °C inkubiert.

Das Plasmid für gendefiziente T. asahii-Stämme wurde gemäß einem früheren Bericht34 konstruiert. Um den hog1-Gen-defizienten Stamm zu erzeugen, wurden die 5'-UTR und 3'-UTR des hog1-Gens mithilfe der Infusionsmethode (In-Fusion HD Cloning Kit, Takara, Shiga, Japan) in einen pAg1-NAT1-Vektor30 eingeführt. Um die Revertante zu erzeugen, wurden die Hygromycin-Phosphotransferase-Gen-Kassette (hph) und das hog1-Gen in pAg1-hog1(5′UTR)-NAT1-hog1(3′UTR) eingeführt. Die für die PCR-Amplifikation jeder DNA-Region verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Der Gentransfer mittels Elektroporation wurde gemäß einem früheren Bericht33 durchgeführt. Die Fragmente 5′-UTR (hog1)-NAT1-3′-UTR (hog1) oder 5′-UTR (hog1)-hog1-hph-3′-UTR (hog1) wurden durch PCR mit den in der Ergänzungstabelle gezeigten Primern amplifiziert 3. Die T. asahii-kompetenten Zellen (40 µl) mit den DNA-Fragmenten (90–180 ng) wurden in eine Küvette mit 0,2 cm Spalt (Bio-Rad Laboratories, Inc.) gegeben und elektroporiert (Zeitkonstantenprotokoll: 1800 V, 5 ms) unter Verwendung eines Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Die Zellen wurden in Hefepepton-Dextrose mit 0,6 M Sorbitol suspendiert und 3 Stunden bei 27 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf SDA mit Nourseothricin (300 µg/ml) oder Hygromycin B (300 µg/ml) aufgetragen und 3 Tage lang bei 27 °C inkubiert. Die Mutation in das Genom der Kandidaten, die auf den SDA-haltigen Arzneimitteln wachsen, wurde durch PCR mit den in der Ergänzungstabelle 3 gezeigten Primern bestätigt. Informationen zu den Stämmen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Der Temperaturempfindlichkeitstest wurde gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Änderungen durchgeführt34. Die T. asahii-Zellen, die einen Tag lang bei 27 °C auf SDA mit Cefotaxim (100 μg/ml) gezüchtet wurden, wurden in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,01 % Tween 80 suspendiert und durch ein 40 μm-Zellsieb (Corning Inc., Corning, NY, USA). Die Absorption der T. asahii-Zellsuspension bei 630 nm wurde auf 1–1,2 eingestellt. Mit Kochsalzlösung wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf den SDA aufgetragen. Die Agarplatten wurden 48 Stunden lang bei 27, 37 oder 40 °C inkubiert und es wurden Fotos angefertigt.

Für das Wachstum auf flüssigem Medium wurde in dieser Studie Sabouraud-Flüssigmedium (1 % Hipolypepton, 4 % Dextrose) verwendet. Zellsuspensionen der T. asahii-Stämme wurden mit Sabouraud-Flüssigmedium hergestellt. Die T. asahii-Suspensionen (A630 = 0,005) wurden 4 Tage lang bei 27 °C, 37 °C oder 40 °C inkubiert und die Absorption bei 630 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (iMark Mikroplattenlesegerät; Bio-Rad Laboratories Inc.) gemessen. , Hercules, CA, USA).

Der Arzneimittelsensitivitätstest wurde gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Änderungen durchgeführt34. Auf die gleiche Weise wie für den oben beschriebenen Temperaturempfindlichkeitstest wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf das SDA getupft, das NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), Koffein (0,65 mg/ml), Kongorot (400 µg/ml), SDS (0,008 %), H2O2 (3) enthielt mM), Menadion (60 µM), TM (1 µg/ml), DTT (12 mM), MMS (0,05 %), AMPH-B (0,4 µg/ml), FLCZ (18 µg/ml) oder VRCZ ( 0,2 µg/ml). Jede Agarplatte wurde 24–48 Stunden lang bei 27 °C inkubiert und es wurden Fotos angefertigt.

Auf die gleiche Weise wie für den oben beschriebenen Temperaturempfindlichkeitstest wurden Reihen zehnfacher Verdünnungen der Pilzsuspension hergestellt. Fünf Mikroliter jeder Zellsuspension wurden auf den SDA aufgetragen. Die SDA-Platte wurde mit einem UV-Vernetzer (CX-2000; UVP LLC, Upland, USA) UV-Licht ausgesetzt. Jede Agarplatte wurde 24 Stunden lang bei 27 °C inkubiert und es wurden Fotos angefertigt.

Die MHK-Werte wurden durch eine Mikroflüssigkeitsverdünnungsmethode (CLSI, M27-A3) unter Verwendung von Antimykotika-Empfindlichkeitstestplatten (Hefeähnlicher Pilz DP „Eiken“; Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japan)58 bestimmt. Die T. asahii-Zellen auf SDA mit Cefotaxim (100 μg/ml) wurden in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,01 % Tween 80 suspendiert. Die T. asahii-Zellsuspension wurde auf McFarland 1 eingestellt. Jede Pilzsuspension wurde 20-fach in Kochsalzlösung verdünnt. und dann 100-fach in RPMI 1640-Medium (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA) verdünnt, das 0,165 M MOPS (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) (RPMI MOPS) (pH 7,0) enthält. Einhundert Mikroliter jeder Zellsuspension wurden in die Vertiefungen der Antimykotika-Empfindlichkeitstestplatten aufgetragen. Die Testplatten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die MHK-Werte wurden aus den Ergebnissen zweier unabhängiger Experimente ermittelt.

Die Beobachtung der Morphologie wurde gemäß einem früheren Bericht34 durchgeführt. Die T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,01 % Tween 80 suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb (Corning Inc.) filtriert. Die Zellsuspension (10 µL), deren Absorption bei 630 nm auf 1 eingestellt war, wurde zu Sabouraud-Dextrose-Flüssigmedium (90 µL) oder geernteter Seidenraupenhämolymphe (90 µL) gegeben. Die 48 Stunden lang bei 27 °C inkubierte Lösung wurde auf Glasobjektträger gegeben und mit Glasdeckgläsern abgedeckt. Die Proben wurden mit hellem Licht unter einem Mikroskop (CH-30; Olympus, Tokio, Japan) untersucht. Die Bilder wurden zufällig gewonnen. Die Morphologie von T. asahii wurde gemäß einem früheren Bericht59 bestimmt. Die Anzahl der folgenden drei Zelltypen wurde gezählt: Hefe (kugelförmige Zellen, einschließlich aufkeimender Hefen und möglicherweise auch Blastokonidien); Arthrokonidien (≥ 3 runde oder rechteckige Zellen, deren Inneres durch Septen getrennt ist); und Hyphen (Zellen, die auf eine Länge von mindestens 2 Hefezellen verlängert sind und keine Septen besitzen).

Experimente mit Seidenraupeninfektionen wurden gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Änderungen durchgeführt30. Eier von Seidenraupen (Hu·Yo × Tukuba·Ne) wurden von Ehime-Sanshu Co, Ltd. (Ehime, Japan) gekauft. Seidenraupenlarven im fünften Stadium wurden über Nacht mit der künstlichen Nahrung (Silkmate 2S; Ehime-Sanshu Co., Ltd.) gefüttert. Der auf SDA-Platten gezüchtete T. asahii, der einen Tag lang bei 27 °C inkubiert wurde, wurde in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,01 % Tween 80 suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb (Corning Inc.) filtriert. Den Seidenraupen wurde eine 50-µL-Suspension von T. asahii-Zellen verabreicht und die mit T. asahii-Zellen injizierten Seidenraupen wurden bei 37 °C inkubiert.

Die Dosis von T. asahii, die erforderlich ist, um die Hälfte der Seidenraupen abzutöten (LD50), wurde gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Modifikationen bestimmt. 30 T. asahii-Stämme (1 × 102 bis 5,5 × 104 Zellen/50 µL) wurden in die Hämolymphe der Seidenraupe injiziert und Die Seidenraupen wurden bei 37 °C inkubiert. Das Überleben der Seidenraupen (n = 4/Gruppe) nach 72 Stunden wurde aufgezeichnet. Der LD50 wurde aus den kombinierten Daten zweier unabhängiger Experimente durch ein einfaches logistisches Regressionsmodell unter Verwendung von Prism 9.1.2 (GraphPad Software, LLC, San Diego, CA, USA, https://www.graphpad.com/scientific-software/) bestimmt. Prisma/).

Die auf SDA mit Cefotaxim (100 μg/ml) gezüchteten T. asahii-Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,01 % Tween 80 suspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb (Corning Inc.) filtriert. Zehn Mikroliter jeder Zellsuspension (A630 = 1–1,5) wurden zu 90 µL filtersterilisierter Seidenraupenhämolymphe gegeben. Die Zellsuspensionen wurden 4 Tage lang bei 37 °C kultiviert und alle 24 Stunden gesammelt. Die gesammelten Zellsuspensionen wurden 2000-fach mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und 100 μl auf SDA verteilt. Die Anzahl der Kolonien auf dem SDA nach eintägiger Inkubation wurde gezählt.

Alle Experimente wurden mindestens zweimal durchgeführt und repräsentative Ergebnisse werden angezeigt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen in den Seidenraupeninfektionsexperimenten in Abb. 7a wurde mit dem Log-Rank-Test auf der Grundlage von Kurven berechnet, die mit der Kaplan-Meier-Methode mit Prism 9.1.2 ermittelt wurden. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen 0 und 4 Tagen in Abb. 8a wurden mithilfe des Student-t-Tests ausgewertet. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in Abb. 8b wurden mithilfe des Tukey-Tests bewertet.

Die in der vorliegenden Studie generierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Eri Sato, Hiromi Kanai und Sachi Koganesawa (Meiji Pharmaceutical University) für ihre technische Unterstützung bei der Aufzucht der Seidenraupen. Diese Studie wurde durch die JSPS KAKENHI-Zuschussnummern JP20K07022 und JP23K06141 (Wissenschaftliche Forschung (C) an YM) und teilweise durch das Forschungsprogramm zu neu auftretenden und wiederauftretenden Infektionskrankheiten der Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (Zuschussnummer) unterstützt JP20fk0108135h0201 und 23fk0108679h0401 an TS).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yasuhiko Matsumoto und Yu Sugiyama.

Abteilung für Mikrobiologie, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose, Tokio, 204-8588, Japan

Yasuhiko Matsumoto, Yu Sugiyama, Tae Nagamachi, Asami Yoshikawa und Takashi Sugita

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Konzeption und Design der Studie: YM, YS Datenerfassung: YM, YS Analyse und Interpretation der Daten: YM, YS, TN, AY Manuskripterstellung: YM, YS Kritische Überarbeitung: YM, TN, AY, TS Alle Autoren haben gelesen und genehmigte die endgültige Fassung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Yasuhiko Matsumoto.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Matsumoto, Y., Sugiyama, Y., Nagamachi, T. et al. Hog1-vermittelte Stresstoleranz beim pathogenen Pilz Trichosporon asahii. Sci Rep 13, 13539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40825-y

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Eingegangen: 05. Juni 2023

Angenommen: 17. August 2023

Veröffentlicht: 19. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40825-y

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