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Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 282 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Leishmaniose ist eine im Mittelmeerraum endemische Zoonose, bei der Leishmania infantum der Erreger von Infektionen bei Menschen und Hunden ist. Die Charakterisierung dieses Parasiten auf der Ebene der Unterarten kann in epidemiologischen Studien nützlich sein, um den klinischen Verlauf der Krankheit zu bewerten (z. B. resistente Stämme, viszerale und kutane Formen der Leishmaniose) sowie um Infektionsreservoirs zu identifizieren. Die Multilocus-Enzymelektrophorese (MLEE), eine Methode, die derzeit als Referenzmethode zur Charakterisierung und Identifizierung von Leishmania-Stämmen gilt, ist umständlich und zeitaufwändig und erfordert kultivierte Parasiten. Diese Nachteile haben zur Entwicklung anderer Methoden wie der Multilocus-Mikrosatellitentypisierung (MLMT) und der Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) zur Typisierung von Leishmania-Parasiten geführt; Diese Methoden wurden jedoch noch nicht routinemäßig angewendet. In dieser Studie verwendeten wir zunächst MLST, um informative Polymorphismen auf Einzelkopie-Genen zu identifizieren, die für Stoffwechselenzyme kodieren. Anschließend entwickelten wir zwei schnelle Genotypisierungstests auf der Grundlage einer hochauflösenden Schmelzanalyse (HRM), um diese Polymorphismen bei L. infantum-Parasiten zu untersuchen.

Es wurde ein maßgeschneidertes Sequenzierungspanel für 14 Housekeeping-Gene entwickelt und eine MLST-Analyse an neun L. infantum-Stämmen/-Isolaten von Hunden und Menschen durchgeführt. Zwei quantitative Echtzeit-PCR-HRM-Assays wurden entwickelt, um zwei informative Polymorphismen auf den Genen Äpfelsäureenzym (ME) und Glucose-6-Phosphat-Isomerase (GPI) (390T/G bzw. 1831A/G) zu analysieren. Die beiden Tests wurden auf 73 klinische Proben/Isolate aus Mittel-/Süditalien und der Insel Pantelleria angewendet und die Ergebnisse wurden durch DNA-Sequenzierung in einer Untergruppe von Proben bestätigt.

Die MLST-Analyse ermöglichte zusammen mit den in der Genbank-Datenbank verfügbaren Sequenzen die Identifizierung zweier informativer Polymorphismen auf den Genen, die für ME und GPI kodieren. Das schnelle Screening dieser Polymorphismen mithilfe von zwei HRM-basierten Tests in 73 klinischen Proben/Isolaten führte zur Identifizierung von sieben Genotypen. Insgesamt war Genotyp 1 (Sequenztyp 390T/1831G) in der Gesamtstichprobe am stärksten vertreten (45,2 %) und korrelierte mit den häufigsten L. infantum-Zymodemen (MON-1, MON-72). Interessanterweise war auf der Insel Pantelleria der am weitesten verbreitete Genotyp (70,6 %) der Genotyp 6 (Sequenztyp 390T/1831A).

Durch die Anwendung unserer HRM-Tests auf klinische Proben konnten wir sieben verschiedene Genotypen identifizieren, ohne dass eine Parasitenisolierung und -kultivierung erforderlich war. Wir haben gezeigt, dass diese Tests als schnelle, routinemäßige und kostengünstige Instrumente zur epidemiologischen Überwachung von L. infantum oder zur Identifizierung neuer Infektionsreservoirs eingesetzt werden können.

Leishmaniose ist eine im Mittelmeerraum endemische Zoonosekrankheit, die hauptsächlich durch Leishmania infantum verursacht wird, den Erreger der kutanen und viszeralen Leishmaniose beim Menschen (CL bzw. VL) sowie der Leishmaniose beim Hund (CanL). Die Charakterisierung von Leishmanien erfolgt traditionell durch Multilocus-Enzym-Elektrophorese (MLEE), die derzeit von der WHO noch als Referenzmethode für die Parasitentypisierung angesehen wird [1]. MLEE, das am Zentrum für Leishmaniose in Montpellier (Frankreich) entwickelt wurde (MON-System), basiert auf den unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten von 15 Stoffwechselenzymen: Malatdehydrogenase (MDH), Äpfelsäureenzym (ME), Isocitratdehydrogenase (ICD), 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (PGD), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD), Glutamat-Dehydrogenase (GLUD), NADH-Diaphorase (DIA), Purinnukleosidphosphorylase 1 (NP1), Purinnukleosidphosphorylase 2 (NP2), Glutamat-Oxalacetat-Transaminasen 1 und 2 (GOT1, GOT2), Phosphoglucomutase (PGM), Fumarathydratase (FH), Mannose-Phosphat-Isomerase (MPI) und Glucose-6-Phosphat-Isomerase (GPI) [2]. Der Vergleich der Isoenzymmobilität mit einem Referenzstamm hat zur Identifizierung von > 300 Zymodemen geführt, die alle mit MON-Begriffen bezeichnet werden. Bezüglich L. infantum wurden 45 Zymodeme identifiziert. Zoonotische VL und CanL werden hauptsächlich durch MON-1, MON-24, MON-34, MON-72, MON-77, MON-80, MON-98, MON-105, MON-108, MON-199 und MON verursacht -199 NP1130-Variante und MON-281. Insbesondere ist MON-1 das häufigste Zymodem bei Menschen und Hunden [3, 4], gefolgt von MON-72, das in CanL diffuser vorkommt, aber auch bei menschlichen Patienten identifiziert wurde [5]. Im Gegensatz dazu wurden einige Zymodeme (dh MON-11, MON-27, MON-28, MON-29, MON-33, MON-189) nur beim Menschen isoliert [6]. Darüber hinaus wurde bei Patienten mit HIV über mehrere Nicht-MON-1-Parasiten berichtet [7]. Diese Ergebnisse stellen die Rolle von Hunden bei der Übertragung der Krankheit in Frage, die historisch als Hauptinfektionsreservoir für den Menschen galten. Tatsächlich spiegelt die Homogenität der in der Hundepopulation identifizierten Zymodeme nicht die Heterogenität der beim Menschen gefundenen Zymodeme wider.

Die auf MLEE basierende Charakterisierung von Leishmanien weist eine Reihe von Einschränkungen auf: Sie ist zeitaufwändig und umständlich, erfordert die Isolierung und Kultivierung von Parasiten und kann nur in wenigen Labors durchgeführt werden. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden verschiedene biomolekulare Ansätze vorgeschlagen, darunter Multilocus Sequence Typing (MLST) [8] und Multilocus Microsatellite Typing (MLMT) [9]. Trotz der Robustheit des MLST-Ergebnisses ist die direkte Anwendung dieser Methode auf klinische Proben jedoch aufgrund ihrer begrenzten Empfindlichkeit schwierig: Sie basiert hauptsächlich auf Einzelkopie-Genen. Darüber hinaus ist die parallele Amplifikation mehrerer Gene und deren Sequenzierung kostspielig und zeitaufwändig. Im Vergleich dazu wurde MLMT bei klinischen Proben eingesetzt [9], die Methode erfordert jedoch mehrere PCR-Amplifikationen und eine Kapillargelelektrophoreseanalyse. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese beiden Techniken zeitaufwändig und relativ teuer sind und möglicherweise eine Isolierung des Parasiten erfordern. Daher kann ihre Anwendbarkeit in epidemiologischen Studien und klinischen Routinen eine Herausforderung darstellen.

In diesem Zusammenhang haben wir in einer früheren Studie einen alternativen Ansatz entwickelt, der auf einem hochauflösenden Schmelztest (HRM) basiert, um die häufigsten Zymodeme (d. h. MON-1, MON-72, MON-201 [außer MHOM/TN/ 80/IPT1, ein MON-1-Zymodem aus Tunesien]), das den Polymorphismus 390T>G im Malic-Enzym (ME)-Gen ausnutzt, was eine teilweise, wenn auch nicht eindeutige Übereinstimmung zwischen Genotypisierungsergebnissen und MLEE-Ergebnissen belegt [10]. In der vorliegenden Studie, die eine Erweiterung der vorherigen darstellt, haben wir ein MLST-Panel für 14 Gene entworfen, die für Enzyme kodieren, die für MLEE verwendet werden, mit den Zielen: (i) weitere Polymorphismen zu identifizieren, die für die Typisierung von L. infantum nützlich sind; und (ii) HRM-basierte Tests für die aussagekräftigsten Polymorphismen zu entwickeln und anzuwenden, um eine schnelle und kostengünstige Charakterisierung von L. infantum-Stämmen durchzuführen.

Die in dieser Studie analysierten Stämme, Isolate und klinischen Proben von Leishmania infantum sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die klinischen Proben bestanden aus peripherem Blut (gewonnen durch Venenpunktion in EDTA-Röhrchen); Buffy-Coat (dh weiße Blutkörperchen, die nach 10-minütiger Vollblutzentrifugation bei 210 g gesammelt wurden); Knochenmark- und Lymphknotennadelaspirate (geerntet in EDTA-Röhrchen zur Blutentnahme); Hautabstriche und Hautbiopsien von Hautläsionen (entnommen mit einem sterilen Wattestäbchen bzw. einer Biopsiestanze), gesammelt in sterilen Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS); und Bindehautabstriche (d. h. exfoliative Epithelzellen, die mit sterilen Wattestäbchen aus dem unteren Bindehautsack entnommen werden). Klinische Isolate wurden aus frischen Lymphknotenaspiraten oder Hautbiopsien gewonnen, wie zuvor beschrieben [11]. Klinische Proben und Isolate wurden zwischen 2015 und 2021 in Mittel- und Süditalien gesammelt; Ein Teil davon stammte von einer Hundepopulation, die in einem Zwinger auf der Insel Pantelleria lebte, einer kleinen Insel (80 km2) südwestlich von Sizilien und 60 km östlich der tunesischen Küste.

Die Probennummern 13–26, 41–60 und 66–93 (Tabelle 1) wurden vom OIE Reference Laboratory National Reference Centre for Leishmaniasis (C.Re.Na.L.) (Palermo, Italien) bereitgestellt [12, 13]. Zusätzliche menschliche Proben (Nr. 27, 61–65; Tabelle 1) wurden von der Abteilung für Infektionskrankheiten des Krankenhauses Marche Nord (Pesaro, Italien) bezogen. Die Parasitenisolierung von Probe 27 (Tabelle 1) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [14, 15]. Die klinischen Hundeproben (Nr. 28–40; Tabelle 1) wurden von der Tierklinik „Santa Teresa“ in Fano (Region Marken, Italien) bereitgestellt. Alle Proben wurden im Rahmen des diagnostischen Verfahrens während der Routineuntersuchung entnommen, mit Ausnahme der Bindehautabstriche, die zu Forschungszwecken entnommen wurden (siehe Erklärung zur Ethikgenehmigung und Einwilligung zur Teilnahme am Ende des Artikels).

Alle menschlichen und veterinärmedizinischen Proben wurden als positiv für Leishmania spp. diagnostiziert. durch objektive Bewertung, serologische Tests [dh IFAT, SNAP-Tests (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA) oder der Speed-Leish-K-Test (BVT Groupe Virbac, La Seyne sur Mer, Frankreich)] und/oder durch zytohistologische Untersuchung. Darüber hinaus wurde nach der DNA-Extraktion (siehe folgender Abschnitt) die Probenpositivität mittels qPCR-ML-Analyse bewertet [16]. Um das Vorhandensein von L. infantum-Arten zu bestätigen, wurde eine molekulare Identifizierung mit einem qPCR-basierten Test [17] oder einem internen Transkripter-Spacer-1-PCR-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (ITS1-PCR RFLP) gemäß Schönian et al. durchgeführt. [18]. Kurz gesagt, die PCR-Produkte wurden mit 10 U HaeIII (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 3 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Die Restriktionsfragmente wurden auf einem 3,5 % hochauflösenden MetaPhor-Agarosegel (Cambrex Corp., East Rutherford, NJ, USA) sichtbar gemacht.

DNA aus kultivierten Parasiten (Referenzstämme oder klinische Isolate) und klinischen Proben (mit Ausnahme von Bindehautabstrichen) wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert und anschließend mit einem Qubit-Fluorometer quantifiziert (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). DNA aus Bindehautabstrichen wurde wie zuvor beschrieben aus Rohlysaten gewonnen [19]. Kurz gesagt, die Abstriche wurden 2 Stunden lang bei 56 °C in 200 μl Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 0,5 % Nonidet P40, 0,5 % Tween 20, 0,1 mg/ml Proteinase K) inkubiert. Nach der Abstrichentfernung wurden die Proben 10 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert.

Für den MLST-Assay wurden insgesamt 14 proteinkodierende Gene ausgewählt: Elongationsinitiationsfaktor 2alpha, Spermidinsynthase 1, ICD, GPI, Inosin-Guanin-Nukleosidhydrolase, unspezifische Nukleosidhydrolase, ME, Phosphomannose-Isomerase, G6PD, Malatdehydrogenase, Arginase, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, Phosphomannomutase und UDP-N-Acetylglucosamin-Dolichylphosphat-N-Acetylglucosaminphosphotransferase. Ein maßgeschneidertes Sequenzierungspanel wurde mit dem Ion AmpliSeq™ Designer v7.0.6-Tool (Thermo Fisher Scientific) entworfen, wobei das L. infantum JPCM5-Genom (Assembly GCA_900180445.1) als Referenz verwendet wurde (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Dieses Panel bestand aus zwei Primer-Pools mit 88 verschiedenen Amplicons. Die neun sequenzierten Leishmania-Stämme/-Isolate sind in Tabelle 1 aufgeführt (hochgestellte „2“: 5 Hunde-Isolate von der Insel Pantelleria und Mittelitalien und 4 menschliche Isolate/Stämme aus Tunesien, Frankreich, Mittel- und Süditalien). Die Vorbereitung der DNA-Bibliothek wurde mit dem Ion AmpliSeq™ Library Kit Plus (Thermo Fisher Scientific) ausgehend von 5 ng DNA durchgeführt. Die Sequenzierung der Bibliotheken wurde mit dem Ion Torrent S5-Instrument (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Nach der Sequenzierung wurden die Lesevorgänge mithilfe des Torrent-Browsers dem JPCM5-Genom von L. infantum (Release-Version TriTrypDB-45_LinfantumJPCM5_Genome) zugeordnet. Varianten wurden mit LoFreq in Galaxy (Galaxy Version 2.1.5 + Galaxy0) [20] unter Verwendung der Standardeinstellungen aufgerufen. Zur Variantenvisualisierung wurden Integrative Genomics Viewer oder Ugene verwendet. Anschließend wurde mit der MEGAX-Software eine molekulare phylogenetische Analyse nach der Maximum-Likelihood-Methode basierend auf dem General Time Reversible-Modell [21] durchgeführt.

Der Polymorphism Information Content (PIC) für Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) wurde wie für dominante Marker unter Verwendung der vereinfachten Gleichung berechnet, die in Serrote et al. beschrieben ist. [22].

PCR-Produkte, die informative Polymorphismen der ME- und GPI-Gene umfassen (d. h. 390T/G und 1831A/G, wie in den Referenzsequenzen DQ449701.1 bzw. AJ620617.1), wurden mithilfe eines verschachtelten Ansatzes mit vier Primerpaaren erhalten (Tabelle 2). Die beiden externen Primerpaare (einschließlich eines zuvor veröffentlichten Primerpaars [10]) wurden verwendet, um den Voramplifikationsschritt mit konventioneller PCR (cPCR) durchzuführen, während die beiden internen Primerpaare für den zweiten Amplifikationsschritt mit qPCR verwendet wurden, gefolgt von HRM-Analyse. Die Primer wurden mit Primer-BLAST [23, 24] unter Verwendung des L. infantum-Äpfelenzyms MHOM/FR/78/LEM75 und der GPI-Sequenzen MHOM/TN/80/IPT1 als Referenz entworfen. Die Primerpositionen auf den Zielgenen und den polymorphen Nukleotiden sind in der Zusatzdatei 2: Abbildung S1 und der Zusatzdatei 3: Abbildung S2 dargestellt.

Um die Amplifikation klinischer Proben mit geringer Parasitenlast sicherzustellen, haben wir einen Voramplifikationsschritt mit externen Primern in die cPCR integriert. Die cPCR wurde doppelt in einem Endreaktionsvolumen von 25 μl durchgeführt, das 2 μl Matrizen-DNA, 200 μM dNTP, 2,5 mM MgCl2, 200 nM jedes Primers und 1 U Hot-Rescue-DNA-Polymerase (Diatheva srl, Fano, Italien) enthielt ). Die Amplifikation wurde in einem GeneAmp® PCR System 2700-Thermocycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) mit einem Temperaturwechselprofil von 94 °C für 7 Minuten, gefolgt von 15 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden und 60 °C für 20 s und 72 °C für 15 s. Als Negativkontrolle wurde ein Röhrchen ohne Vorlage mitgeliefert.

Die Tests qPCR-ME65 und qPCR-GPI88 führten zu amplifizierten Produkten von 65 bzw. 88 bp, die die Polymorphismen 390T/G (qPCR-ME65) bzw. 1831A/G (qPCR-GPI88) umfassten. Alle qPCRs wurden in einem Reaktionsvolumen von 25 μl durchgeführt, das 1 μl Template-DNA (gereinigte genomische DNA für Kontrollproben und voramplifiziertes PCR-Produkt für klinische Proben) und 12,5 μl TB Green PreMix ex Taq II Master Mix (Takara Bio) enthielt Europa, Saint-Germain-en-Laye, Frankreich), mit 200 nM jedes Primers. Die qPCR-Reaktionen wurden in einem Rotor-Gene 6000-Gerät (Corbett Life Science, Mortlake, Australien) mit einem Temperaturwechselprofil von 94 °C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen bei 94 °C für 20 Sekunden und 60 °C, durchgeführt für 20 s und 72 °C für 20 s. Jede Probe wurde in zweifacher Ausfertigung durchgeführt, und in jedem Durchlauf wurde keine Template-Kontrolle verarbeitet. Nach der Amplifikation wurde die HRM-Analyse im Bereich von 77–88 °C mit Anstiegen von 0,1 °C/s und einer Wartezeit von 2 s bei jeder Temperatur durchgeführt. Rohe HRM-Kurven wurden mit der Software Rotor-gene 6000 v.1.7 (Corbett Life Science) normalisiert. Im qPCR-ME65-Assay wurden die Stämme MHOM/FR/78/LEM75 und MHOM/TN/80/IPT1 als Referenzen für die Genotypen 390T bzw. 390G verwendet; Im qPCR-GPI88-Assay wurden die Stämme MHOM/FR/78/LEM75, MHOM/TN/80/IPT1 und MHOM/IT/93/ISS822 als Referenz für die Genotypen 1831G, 1831A und 1831R (heterozygot) verwendet. Die Zuordnung der Genotypen 390T/G und 1831A/G wurde von der Gerätesoftware mit einer Konfidenz von ≥ 85 % durchgeführt.

Um die Spezifität der neuen Primerpaare (MEint-F/ME65-R, GPIext-F/GPIext-R und GPI88-F/GPI88-R) zu bewerten, führten wir eine qPCR wie oben beschrieben mit 1 × 10–2 ng L durch . infantum-DNA (Stämme MHOM/FR/78/LEM75 und MHOM/TN/80/IPT1) und 30 ng DNA von Menschen, Hunden, Katzen und Trypanosoma cruzi als Matrize. Amplifizierte Fragmente wurden durch 1,8 % Agarosegelelektrophorese mit Midori Green Advance DNA-Färbung (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, Düren, Deutschland) analysiert. Die Gele wurden unter UV-Licht mit einem Gel-Doc-Gerät (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) sichtbar gemacht. Als Größenstandard war die GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) enthalten.

Um die Empfindlichkeit und Anwendbarkeit der ME65- und GPI88-qPCRs auf klinische Proben abzuschätzen, haben wir Standardkurven mit Reihenverdünnungen von MHOM/FR/78/LEM75-DNA im Bereich von 1 × 100 bis 1 × 10−5 ng pro Reaktionsgefäß erstellt. Um die potenzielle Beeinträchtigung der Wirts-DNA als Hintergrund im qPCR-Assay zu bewerten, wurde jedes qPCR-Reaktionsröhrchen mit 30 ng menschlicher und Hunde-DNA versetzt, die aus menschlichen und Hunde-Zelllinien (MCF7 bzw. DH82) gereinigt wurde. Die Standardkurven wurden aus zwei unabhängigen Experimenten erhalten, die doppelt durchgeführt wurden.

Um den von der Rotorgene-Software zugewiesenen Genotyp zu bestätigen, wurden die mit externen Primern erhaltenen Amplifikationsprodukte mit dem MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt und direkt sequenziert. Insgesamt wurden 23 bzw. 44 PCR-Produkte für die ME- bzw. GPI-Gene sequenziert. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem BigDye Terminator v.11 Cycle Sequencing Kit auf einem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (beide Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die Elektropherogramme wurden mit dem BioEdit Sequence Alignment Editor analysiert [25]. Der heterozygote Genotyp wurde zugeordnet, wenn zwei verschiedene überlappende Peaks an derselben Position beobachtet wurden.

Um die unterschiedlichen HRM-Temperaturen zwischen den Genotypen zu bewerten, führten wir einen Kruskal-Wallis-Test durch, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. Alle statistischen Tests wurden mit GraphPad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt der technischen Replikate für jede Probe aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung (SD) angezeigt.

Die Ergebnisse des MLST (Sequence Read Archive [SRA]-Zugangsnr.: PRJNA911512) zeigten nahezu identische Sequenzen (1–3 Fehlpaarungen im Vergleich zum Referenzgenom von 15.488 Basen) in allen Proben, unabhängig von der geografischen Herkunft oder dem Wirt mit Ausnahme des menschlichen Isolats aus Mittelitalien, MHOM/IT/2019/cur-1, das 25 Fehlpaarungen aufwies (Tabelle 3). Insbesondere zeigte die phylogenetische Analyse, dass das Isolat MHOM/IT/2019/cur-1 unabhängig von den anderen L. infantum-Proben Cluster bildete (Abb. 1). Die Analyse der MLST-Ergebnisse zusammen mit den in Genbank verfügbaren Sequenzen (siehe Tabellen 3 und 6 in [10]) ermöglichte die Bestätigung des Polymorphismus 390T/G auf dem ME-Gen (entsprechend dem Nukleotid 281164 auf Chromosom 24 auf dem Referenz-L. infantum). JPCM5-Genom GCA_900500625.2) und des Polymorphismus 1831A/G auf dem GPI-Gen (entsprechend Nukleotid 292809 auf Chromosom 12 auf dem Referenz-L. infantum JPCM5-Genom GCA_900500625.2), als der informativste unter allen gefundenen Polymorphismen (PIC = 0,47 bzw. 0,35). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden zwei HRM-basierte Assays (dh qPCR-ME65 und qPCR-GPI88) entwickelt, um diese Polymorphismen in klinischen Proben schnell zu erkennen. Der erste ist eine Aktualisierung eines zuvor veröffentlichten Assays [10] und der zweite ist ein völlig neuartiger Assay.

Molekulare phylogenetische Analyse nach der Maximum-Likelihood-Methode. Die Evolutionsgeschichte wurde mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode und des allgemeinen zeitreversiblen Modells abgeleitet. Der Baum mit der höchsten Log-Likelihood (− 21365,37) wird angezeigt. Der Prozentsatz der Bäume, in denen sich die zugehörigen Taxa gruppieren, wird neben den Zweigen angezeigt. Die ursprünglichen Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch erhalten, indem Neighbor-Joining- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix paarweiser Abstände angewendet wurden, die mithilfe des Maximum Composite Likelihood (MCL)-Ansatzes geschätzt wurden, und dann die Topologie mit dem überlegenen Log-Likelihood-Wert ausgewählt wurde

Die neuen Primerpaare (MEint-F/ME65-R, GPIext-F/GPIext-R und GPI88-F/GPI88-R) wurden mittels qPCR getestet, um ihre Spezifität anhand von DNA aus L. infantum, T. cruzi und Menschen zu bewerten , Hunde- und Katzenproben. Amplifizierte Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Die erhaltenen Produkte hatten die erwartete Größe und es wurde keine unspezifische Amplifikation festgestellt (Zusatzdatei 4: Abbildung S3).

Die Sensitivitätskurven für qPCR ME65 und qPCR GPI88 zeigten eine Quantifizierungsgrenze von 1 × 10−4 ng DNA pro PCR-Röhrchen mit R2 > 0,99 (Abb. 2). In Gegenwart von menschlicher und Hunde-DNA als Hintergrund verzögerte sich der Quantifizierungszyklus (Cq) leicht, aber die Linearität und die Quantifizierungsgrenze des Tests blieben unverändert.

Empfindlichkeitskurven des qPCR-ME65-Assays (a) und des qPCR-GPI88-Assays (b). Die Standardkurven wurden mit 30 ng menschlicher oder Hunde-DNA versetzt (obere Kurven teilweise überlappend, Punkte mit Kreisen bzw. Dreiecken) oder ohne Zusatz (untere Kurve, quadratische Punkte). Jeder Punkt stellt ein doppeltes Ergebnis zweier unabhängiger Experimente dar. Cq, Quantifizierungszyklus; GPI, Glucose-6-Phosphat-Isomerase; ME, Äpfelsäureenzym; qPCR, quantitative Echtzeit-PCR

Um die Fähigkeit der HRM-Assays zur Unterscheidung der Genotypen zu bewerten, wurden die beiden qPCR-Assays (qPCR-ME65 und qPCR-GPI88) zunächst an acht L. infantum-Stämmen (Proben-Nr. 13–20, Tabelle 1) mit bekanntem getestet Sequenzen. Die Stämme Leishmania infantum MHOM/FR/78/LEM75, MHOM/TN/80/IPT1 und MHOM/IT/93/ISS822 wurden als Referenzen für die Genotypen 390T/1831G, 390G/1831A bzw. 390T/1831R ausgewählt. Die qPCR- und HRM-Analysen wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben durchgeführt und die Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Genotypen entweder durch HRM-Kurvenanalyse (negatives Ableitungsdiagramm) oder HRM-normalisierte Profile unterschieden werden konnten (Abb. 3). Insbesondere der heterozygote GPI-Stamm (1831R) war sowohl mit den negativen Ableitungsdiagrammen (mit einem typischen Doppelpeak; Abb. 3c) als auch mit normalisierten HRM-Profilen, die eine charakteristische Form zeigten (Abb. 3d), deutlich unterscheidbar. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit den Stämmen MHOM/DZ/82/LIPA59 (390G/1831A), MHOM/ES/81/BCN1 (390G/1831G), MHOM/IT/86/ISS218 (390T/1831G), MHOM/IT/ 08/31U (390T/1831G) und MHOM/IT/08/49U (390T/1831G) (Ergebnisse nicht angezeigt).

HRM-Analyse von Leishmania infantum-Referenzstämmen. a, b qPCR-ME65 HRM-negative Derivatdiagramme (a) und normalisierte Profile (b) wurden unter Verwendung von DNA von MHOM/TN/80/IPT1 (Genotyp 390G) und MHOM/FR/78/LEM75 (Genotyp 390T) erhalten. c, d qPCR-GPI88 HRM negative Ableitungsdiagramme (c) und normalisierte Profile (d) wurden unter Verwendung von DNA von MHOM/TN/80/IPT1 (Genotyp 1831A), MHOM/FR/78/LEM75 (Genotyp 1831G) und MHOM erhalten /IT/93/ISS822 (Genotyp 1831R). dF/dT, Ableitung der Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen Temperaturen; GPI, Glucose-6-Phosphat-Isomerase; HRM, hochauflösendes Schmelzen; ME, Äpfelsäureenzym; qPCR, quantitative Echtzeit-PCR; T, Temperatur

Nachdem das Potenzial der beiden qPCR-Assays zur Unterscheidung der Genotypen 390T/G und 1831A/G in Referenzstämmen nachgewiesen wurde, wurden diese beiden Assays an neun klinischen Isolaten und 64 klinischen Proben von Menschen und Hunden aus Mittel-/Süditalien und der Insel Pantelleria getestet mit dem Ziel, die genetische Variabilität von L. infantum in diesen Bereichen mithilfe der HRM-basierten Methode zu bewerten. Erstens wurde das Vorhandensein von L. infantum in klinischen Proben durch ITS1-PCR RFLP [18] und/oder durch qPCRs bestätigt, die auf Kinetoplasten-DNA (kDNA)-Minikreise abzielen [16]. Um die Empfindlichkeit und Robustheit der 390T/G- und 1831A/G-HRM-Assays an klinischen Proben zu erhöhen, in denen die Parasiten-DNA schlecht vertreten war, wurden 15 Zyklen des Voramplifikationsschritts unter Verwendung des externen Primerpaars eingeführt, wie in beschrieben Abschnitt „Methoden“. Anschließend wurde 1 µl der Reaktion als Vorlage für die qPCR-Assays verwendet. Die Genotypen von 61 und 53 Proben wurden durch die Tests qPCR-ME65 bzw. qPCR-GPI88 in den 64 verfügbaren klinischen Proben unterschieden und zeigten eine Sensitivität von 95,3 % bzw. 82,8 %. Bemerkenswert ist, dass die Sensitivität bei klinischen Isolaten 100 % erreichte (9 von 9 bei beiden Tests). Ein Beispiel für negative Ableitungsdiagramme und normalisierte HRM-Profile, die mit den klinischen Proben erhalten wurden, ist in Abb. 4 dargestellt. Interessanterweise zeigten die menschlichen Proben 2073U und 2604U ein normalisiertes HRM-Profil und einen HRM-Doppelpeak, der sowohl für ME als auch für GPI auf den heterozygoten Genotyp zurückzuführen ist Gene (390K/1831R) (Abb. 4). Aufgrund des Fehlens eines heterozygoten Referenzstamms für das ME-Gen wurden diese Amplifikate wie oben beschrieben sequenziert. Die Elektropherogramme zeigten einen Doppelpeak an Position 390, der mit Heterozygotie (390 K) kompatibel ist (Zusatzdatei 5: Abbildung S4).

HRM-Analyse klinischer Proben von Leishmania infantum. a, b qPCR-ME65 HRM negative Ableitungsdiagramme (a) und normalisierte Profile (b) ausgewählter klinischer Proben. Als Referenzen wurden die Stämme MHOM/TN/80/IPT1 (Genotyp 390G) und MHOM/FR/78/LEM75 (Genotyp 390 T) in den Test einbezogen. c, d qPCR-GPI88 HRM negative Ableitungsdiagramme (c) und normalisierte Profile (d) ausgewählter klinischer Proben. Als Referenzen wurden die Stämme MHOM/TN/80/IPT1 (Genotyp 1831A), MHOM/FR/78/LEM75 (Genotyp 1831G) und MHOM/IT/93/ISS822 (Genotyp 1831R) in den Test einbezogen. dF/dT, Ableitung der Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen Temperaturen; HRM, hochauflösendes Schmelzen; GPI, Glucose-6-Phosphat-Isomerase; ME, Äpfelsäureenzym; qPCR, quantitative Echtzeit-PCR

Die Genotyp-Diskriminierungsleistung der qPCR-ME65- und qPCR-GPI88-Assays wurde auch durch die Analyse der HRM-Temperaturen aller L. infantum-Proben bewertet. Der qPCR-ME65-Assay lieferte Hinweise auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der mittleren (± SD) Schmelztemperatur (Tm) des Genotyps 390G (83,56 °C ± 0,09 °C) und der der Genotypen 390T oder 390K (82,91 °C ± 0,11 °). C bzw. 82,97 °C ± 0,04 °C) (Kruskal-Wallis, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest, P <0,001) (Abb. 5a), was die Anwendbarkeit der Methode für klinische Proben bestätigt. Ebenso ermöglichte der mittlere Tm (± SD) im qPCR-GPI88-Assay die Unterscheidung der Proben mit Genotyp 1831G (81,85 °C ± 0,12 °C) von Proben mit Genotyp 1831A oder 1831R (81,30 °C ± 0,11 °). C bzw. 81,41 °C ± 0,14 °C) (Kruskal-Wallis, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest, P <0,001) (Abb. 5b). Allerdings zeigte die Tm der Proben mit heterozygoten Amplifikaten (d. h. 390K und 1831R) eine teilweise Überlappung mit der Tm der Proben mit Genotyp 390T bzw. 1831A; Daher konnten die beiden Genotypen nicht ausschließlich anhand des Tm unterschieden werden. Dieser Nachteil kann jedoch durch das Vorhandensein des zweiten HRM-Peaks behoben werden. Obwohl die Analyse dieses zweiten Peaks eine Senkung der Fluoreszenzschwelle erforderte, war der Peak vom Hintergrund unterscheidbar und zeigte eine mittlere Tm (± SD) von 80,39 °C ± 0,08 °C und 79,40 °C ± 0,14 °C für 390 K bzw. 1831R-Amplikons (Abb. 4a, c). Dieses Merkmal heterozygoter Proben wurde durch die HRM-normalisierten Profile bestätigt (Abb. 4b, d).

HRM-Temperaturen von Leishmania infantum-Proben. a HRM-Temperaturen von Amplikons, die durch qPCR-ME65 erhalten wurden, b HRM-Temperaturen von Amplifikaten, die durch qPCR-GPI88 erhalten wurden. Die Temperaturen stellen den Mittelwert ± SD der technischen Wiederholungen von mindestens zwei unabhängigen Experimenten dar. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied bei ***p < 0,001, Kruskal-Wallis, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. HRM, hochauflösendes Schmelzen; GPI, Glucose-6-Phosphat-Isomerase; ME, Äpfelsäureenzym; qPCR, quantitative Echtzeit-PCR

Um den von der Rotorgene-Software auf Basis der HRM-Analyse zugewiesenen Genotyp zu bestätigen, haben wir zunächst die Amplifikationsprodukte der Referenzstämme und vieler klinischer Proben gereinigt und diese dann wie unter „Methoden“ beschrieben sequenziert. Andere Sequenzen wurden vom MLST-Gremium (SRA-Zugangsnummer: PRJNA911512) oder aus unserer vorherigen Veröffentlichung erhalten [10]. Das Vorhandensein zweier verschiedener überlappender Peaks an derselben Nukleotidposition war mit einem heterozygoten Genotyp verbunden. Zusammenfassend waren 43 und 53 Sequenzen verfügbar, die die Polymorphismen in den ME- und GPI-Genen umfassten. Die Ergebnisse zeigten eine 100-prozentige Korrelation mit der Genotypbestimmung auf Basis der HRM-Assays. Zusatzdatei 5: Abbildung S4 und Zusatzdatei 6: Abbildung S5 zeigen Elektropherogramme ausgewählter klinischer Amplikons, die mit qPCR-MEint bzw. qPCR-GPIext erhalten wurden.

Basierend auf den Ergebnissen der gleichzeitigen Analyse der beiden Polymorphismen konnten wir in 82 von 93 Proben sieben verschiedene Genotypen (G1-G7) zuordnen. Unter diesen sieben Genotypen war Genotyp 1 (G1) am häufigsten vertreten (38 von 82 Proben; Prävalenz 46,3 %) (Tabelle 4). Die Genotypisierungsergebnisse für jeden L. infantum-Stamm, jede klinische Probe und jedes klinische Isolat sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Es ist bemerkenswert, dass der G1-Genotyp 12 von 14 (85,7 %) L. infantum-Stämmen/-Isolaten charakterisierte, die zu MON-1 und MON gehören -72 Zymodeme. Im Gegensatz dazu wurde der G1-Genotyp in keinem der Nicht-MON-1/MON-72-Zymodeme gefunden (Tabelle 5). Mit Ausnahme der Proben von der Insel Pantelleria wurde G1 als der häufigste Genotyp sowohl in der menschlichen (Prävalenz 42,9 %) als auch in der Hundepopulation (Prävalenz 84,6 %) bestätigt; Insbesondere zeigten menschliche Proben im Vergleich zu denen von Hunden eine größere genetische Variabilität (Abb. 6). Im Inselkontext der Insel Pantelleria ist die Situation bei Hundeproben jedoch völlig umgekehrt: 12 von 17 Proben zeigten den Genotyp 6 (G6) (390T/1831A; Prävalenz von 70,6 %), und der G1-Genotyp hatte eine Prävalenz von nur 23,5 % (Abb. 6). Die Hundeprobe Els-mai, die aus der Tierklinik „Santa Teresa“ in Fano (Mittelitalien) stammte, war ein ungewöhnlicher Fall, bei dem die beiden Bindehautabstriche zu zwei unterschiedlichen Genotypen gehörten (Els-maia: G6; Els-maib: G1). Darüber hinaus zeigten zwei menschliche Proben (dh 2073U, 2604U) Heterozygotie sowohl bei ME- als auch bei GPI-Polymorphismen (G7).

Genotypverteilung in menschlichen und Hundeproben. Menschliche Proben (n = 49) umfassen alle sieben Genotypen mit einer deutlichen Prävalenz des G1-Genotyps (42,9 %), gefolgt von den G3- (22,4 %) und G5-Genotypen (14,3 %). Hundeproben aus Mittel-/Süditalien (n = 13) zeigten eine deutliche Prävalenz des G1-Genotyps (84,6 %), während Hundeproben von der Insel Pantelleria (n = 17) eine Prävalenz des G6-Genotyps (70,6 %) zeigten.

Die Taxonomie der Gattung Leishmania ist sehr komplex und wurde im Laufe der Jahre mehrmals entsprechend den biochemischen und biologischen Eigenschaften der Parasiten überarbeitet [26]. In der vorliegenden Studie haben wir uns auf L. infantum-Arten konzentriert, den Hauptverursacher von CanL und menschlichem VL und CL. Die Typisierung von Leishmanien auf Arten- und Stammebene ist wichtig für epidemiologische Studien [27], zur Identifizierung neuer Reservoirs und zur Vorhersage des klinischen Infektionsverlaufs, insbesondere beim Menschen (dermotrope und viszerotrope Stämme) [28]. Die Referenztechnik zur Typisierung von Mitgliedern der Gattung Leishmania ist die MLEE-Methode [1], die auf der elektrophoretischen Mobilität verschiedener aus den Promastigoten gewonnener Enzyme basiert. Basierend auf dieser Technik werden Leishmania-Arten in Zymodeme (auch als MON bezeichnet) klassifiziert. In Italien sind MON-1 und MON-72 die am stärksten vertretenen L. infantum-Zymodeme bei infizierten Hunden, während Infektionen beim Menschen durch eine heterogenere Zymodempopulation verursacht werden [27], was darauf hindeutet, dass Hunde nicht die einzigen Infektionsreservoirs sind und betont die Bedeutung epidemiologischer Studien. Eine aktuelle Arbeit von Castelli et al. [29] in Sizilien (Italien) an Leishmania-Isolaten von Menschen und Hunden durchgeführt, ergab, dass 71 von 78 Proben (91 %) MON-1 waren, was als vorherrschendes Zymodem im Mittelmeerraum bestätigt wurde; die restlichen sieben Proben (9 %) waren Nicht-MON-1. Insbesondere die Nicht-MON-1-Stämme wurden aus Menschen isoliert. Darüber hinaus untersuchen immer mehr Studien die Rolle anderer Säugetiere als Leishmanienreservoir, wie Hasen [30], Kaninchen [31], Wölfe [32] und insbesondere Hauskatzen [33]. In diesem Zusammenhang könnte ein Ansatz, der eine schnelle Parasitencharakterisierung ermöglicht, für epidemiologische Studien nützlich sein. Allerdings ist die MLEE-Technik mit einer Reihe von Einschränkungen verbunden, einschließlich der Notwendigkeit einer Parasitenkultivierung. Als Alternative zu MLEE wurden zusätzlich zu den MLST- und MLMT-Methoden andere Ansätze zur Charakterisierung der genetischen Vielfalt in L. infantum-Populationen versucht. Insbesondere neuere Studien haben den SNP auf kDNA-Minikreisen genutzt, um verschiedene L. infantum-Genotypen im Mittelmeerraum zu identifizieren (34, 35). Dieser Ansatz basierte auf der PCR-Amplifikation einer Minicircle-Region, gefolgt von RFLP-Analyse oder DNA-Sequenzierung und anschließender In-silico-RFLP.

Ziel der vorliegenden Studie war es, eine alternative, schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Untersuchung der genetischen Variabilität von L. infantum zu finden, die im Mittelmeerraum zirkuliert. Wir konzentrierten uns daher auf die HRM-basierte Überwachung von SNPs, die in Stoffwechselenzymen gefunden werden, die im MLEE-Ansatz verwendet werden. Um Polymorphismen zu identifizieren, die für die schnelle Typisierung von L. infantum nützlich sind, haben wir zunächst ein benutzerdefiniertes MLST-Panel entworfen und dann neun L. infantum-Stämme und klinische Isolate sequenziert. Basierend auf den Ergebnissen des MLST-Panels wurde ein informativer Polymorphismus auf GPI-Genen (1831A/G) identifiziert und ausgewählt, um einen qPCR-HRM-basierten Assay für das klinische Probenscreening zu entwickeln, der in Verbindung mit einer aktualisierten Genotypisierungsmethode verwendet werden soll, die ursprünglich von entwickelt und angewendet wurde Ceccarelli et al. [10] zum ME-Gen. Bemerkenswerterweise war es aufgrund des Voramplifikationsschritts möglich, diese Methode auf klinische Proben ohne Parasitenisolierung anzuwenden. Dieser Aspekt stellt einen wichtigen Vorteil im Vergleich zu anderen biomolekularen Ansätzen zur Leishmania-Typisierung dar, die an klinischen Stämmen und Isolaten durchgeführt werden [36, 37].

Insbesondere haben wir in unserer früheren Arbeit gezeigt, dass der 390T-Polymorphismus auf dem ME-Gen mit den Zymodemen MON-1, MON-72 und MON-201 assoziiert ist [10]. In der vorliegenden Studie konnten wir durch die gleichzeitige Verwendung der beiden Polymorphismen den Stamm MHOM/IT/93/ISS822 (MON-201) von MON-1 und MON-72 unterscheiden, indem wir die in Position 1831 gefundene Heterozygotie ausnutzten GPI-Gen, wie auch durch Sequenzierung bestätigt (Zusatzdatei 6: Abbildung S5). Heterozygotie wurde auch in den klinischen Isolaten V2921 und MHOM/IT/2019/cur-1 sowie in acht klinischen Proben festgestellt. Die Heterozygotie ist nicht überraschend, da sie bereits früher bei anderen Stoffwechselenzymen des Leishmania donovani-Komplexes berichtet wurde [37], in Verbindung mit der geografischen Herkunft des Parasiten [38]. Allerdings könnte der Nachweis von Heterozygotie einige Einschränkungen für den Test mit sich bringen. Tatsächlich sind Leishmania spp. ist ein Parasit mit einer konstitutiven Aneuploidie [39, 40] und es ist möglich, dass unser HRM-Ansatz die Heterozygotie nur dann identifizieren kann, wenn sie nahe bei 50 % liegt. Dennoch war diese neue HRM-basierte Genotypisierungsmethode, die nur zwei molekulare Ziele nutzte, in der Lage, sieben verschiedene Genotypen (genannt G1-G7) zu unterscheiden. Eine eindeutige Korrelation zwischen den MLEE- und HRM-basierten Genotypisierungstests ist nicht möglich, da die beiden Ansätze unterschiedlich sind. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten jedoch, dass der Genotyp G1 (der am weitesten verbreitete Genotyp) eine starke (wenn auch nicht eindeutige) Korrelation mit den Zymodemen MON-1 und MON-72 aufweist. Tatsächlich wurden 85,7 % der MON-1- und MON-72-Färbungen/Isolate mit verfügbaren ME- und GPI-Sequenzen dem G1-Genotyp zugeordnet. Die einzigen Ausnahmen waren die Referenzstämme MHOM/TN/80/IPT1 und V2921, die, obwohl sie MON-1 waren, den Genotypen G3 bzw. G5 zugeordnet wurden. Es ist möglich, dass die geografische Herkunft des Stammes MHOM/TN/80/IPT1 (ein tunesischer Stamm) oder der Wirt (V2921 wurde aus einem Marder isoliert) zu diesen Unterschieden geführt hat. Trotz der Steigerung der Unterscheidungskraft bei der in der vorliegenden Studie berichteten Methode im Vergleich zu der in unserer vorherigen Veröffentlichung [10] berichteten Methode wurden keine genotypischen Unterschiede zwischen den Zymodemen MON-1 und MON-72 gefunden. Dies stellt jedoch möglicherweise kein Problem dar. Tatsächlich sind MON-1 und MON-72 die am häufigsten vorkommenden Zymodeme bei Hunden [29, 41]; Daher könnte die Identifizierung von Genotypen, die sich von G1 unterscheiden, nützlich sein, um die genaue Rolle von Hunden bei der Übertragung des Erregers zu untersuchen und zu verstehen und um andere Infektionsreservoirs für den Menschen zu identifizieren. Unter Ausschluss der Proben von der Insel Pantelleria wurden 42,9 % bzw. 84,6 % der klinischen Proben/Isolate von Menschen und Hunden dem G1-Genotyp zugeordnet. Basierend auf der Korrelation zwischen G1 und MON-1 kann davon ausgegangen werden, dass die Ergebnisse mit veröffentlichten Daten übereinstimmen, die zeigen, dass MON-1 das vorherrschende Zymodem im Mittelmeerraum ist [5]. Die Tatsache, dass der Anteil des G1-Genotyps in menschlichen Proben etwas mehr als halb so hoch war wie in Hundeproben, scheint die größere genetische Variabilität von Parasiten beim Menschen im Vergleich zu Hunden zu bestätigen, was durch die Berücksichtigung der Rolle anderer Säugetiere als Infektionsreservoir erklärt werden kann. wie oben erwähnt. Bemerkenswerterweise wurden zuvor auch unterschiedliche Genotypverteilungen zwischen Menschen und Hunden in einem kleinen geografischen Gebiet unter Verwendung verschiedener genetischer Marker beschrieben (34), was die Möglichkeit verstärkt, dass beim Menschen zirkulierendes L. infantum auf mehrere Reservoire angewiesen ist. Da der Vergleich des Genotyps von L. infantum zwischen verschiedenen Studien jedoch immer noch durch die Anzahl der verwendeten Methoden und Sequenzen erschwert wird, wäre für ein besseres Verständnis der Parasitenepidemiologie die Vereinheitlichung und Standardisierung molekularer Marker erforderlich.

In Bezug auf Proben von der Insel Pantelleria ist anzumerken, dass diese Insel über ideale Bedingungen zur Untersuchung von Leishmaniose in einer definierten Tierpopulation und in einem umschriebenen und zentralen Gebiet des Mittelmeerbeckens verfügt. Frühere Studien berichteten von einer Leishmaniose-Prävalenz von 27 % in der Hundepopulation der Insel, was der durchschnittlichen Prävalenz in der Region Sizilien entspricht, was auf eine aktive Verbreitung des Parasiten auf der Insel hinweist [12, 42]. In diesem Bereich waren nur 23,5 % der klinischen Isolate/Proben von Hunden mit dem G1-Genotyp assoziiert, während 70,6 % als G6-Genotyp (390T/1831A) identifiziert wurden. Die Anreicherung des G6-Genotyps in Proben von der Insel Pantelleria im Vergleich zu den Genotypen in anderen Proben von der italienischen Halbinsel könnte durch die natürliche Isolation der Insel Pantelleria erklärt werden, die zu einer begrenzten Vermischung der genetischen Gruppen führte.

Zusätzlich zu allen oben genannten Überlegungen haben sich aus einigen klinischen Proben interessante Ergebnisse ergeben. Beispielsweise Cluster von Bra-aii (G3) mit MHOM/TN/80/IPT1 im MLST-Panel, was die Möglichkeit nahelegt, dass es sich um ein MON-1 handelt, was die genotypische Heterogenität innerhalb des MON-1-Zymodems bestätigt, wie in anderen Arbeiten beschrieben [ 43]. Darüber hinaus erhielten wir zwei unterschiedliche Genotypen aus linken und rechten Bindehautabstrichen der klinischen Probe Els-mai von Hunden (G1 bzw. G6), ein Ergebnis, das durch eine mögliche Koinfektion mit zwei verschiedenen Erregerstämmen erklärt werden könnte. Interessante Daten wurden auch aus zwei menschlichen klinischen Proben (dh 2073U, 2604U) erhalten, die zu G7 gehören; Dies waren die einzigen Proben, die heterozygot für das ME-Gen waren.

Insgesamt haben die erzielten Ergebnisse, die durch die PCR-Produktsequenzierung bestätigt wurden, gezeigt, dass unser HRM-Ansatz robust und für die Genotypisierung klinischer Proben sowie für epidemiologische Studien anwendbar ist. Obwohl die Verwendung von nur zwei SNPs aufgrund der geringen Unterscheidungskraft eine Einschränkung für Genotypisierungszwecke darstellen könnte, ermöglichte dieser Ansatz die schnelle Identifizierung von sieben verschiedenen Genotypen, mit dem großen Vorteil, dass an klinischen Proben mit erschwinglichen Reagenzien und ohne die Notwendigkeit eines Parasiten gearbeitet werden konnte Isolierung.

Insgesamt neun L. infantum-Isolate/-Stämme wurden von einem MLST-Panel sequenziert, das 14 Stoffwechselenzyme abdeckt. Die Analyse dieser Sequenzen und der in der Genbank-Datenbank verfügbaren Sequenzen ermöglichte es uns, zwei informative Polymorphismen zu identifizieren, die zur Differenzierung von L. infantum-Genotypen in Proben aus dem Mittelmeerbecken genutzt werden können (390T/G und 1831A/G, jeweils in den ME- und GPI-Genen). ). Zur Differenzierung dieser Genotypen wurden zwei HRM-basierte Tests entwickelt. Die Anwendung dieser Technik auf neun klinische Isolate und 64 klinische Proben ohne Parasitenisolierung ermöglichte es uns, sieben verschiedene Genotypen zu identifizieren. Darüber hinaus fanden wir eine Korrelation zwischen dem Genotyp G1 (390T/1831G) und den Zymodemen MON-1 und MON-72, was eine schnelle Identifizierung der häufigsten L. infantum-Zymodeme ermöglichte. Dies wird in unserer Studie bestätigt, in der G1 42,9 % bzw. 84,6 % der klinischen Proben/Isolate von Menschen und Hunden ausmachte. Interessanterweise änderte sich dieser Prozentsatz auf der Insel Pantelleria, wo die Prävalenz von G1 nur 23,5 % betrug, während die von G6 70,6 % betrug.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz als schnelles und kostengünstiges Screening-Tool zur Charakterisierung klinischer L. infantum-Isolate in epidemiologischen Studien, zur Identifizierung neuer Infektionsreservoirs und zur Untersuchung der genetischen Variabilität von L. infantum Anwendung finden könnte.

Die in der Studie präsentierten MLST-Daten sind im Sequence Read Archive (SRA) des National Center for Biotechnology Information (NCBI)-Repositorys hinterlegt, und die Zugangsnummer (SRA-Zugangsnummer) lautet PRJNA911512.

Hunde-Leishmaniose

Kutane Leishmaniose

Konventionelle PCR

Quantifizierungszyklus

Glucose-6-Phosphat-Isomerase

Hochauflösendes Schmelzen

Kinetoplasten-DNA

Äpfelsäureenzym

Multilocus-Enzymelektrophorese

Multilocus-Mikrosatellitentypisierung

Multilocus-Sequenztypisierung

Sequenzierung der nächsten Generation

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

Quantitative Echtzeit-PCR

Einzelnukleotidpolymorphismen

Schmelztemperatur

Viszerale Leishmaniose

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Referenzen herunterladen

Wir möchten Dr. Sabina Fattori und Dr. Emanuele Gasparini von der Veterinärklinik Santa Teresa, Fano (PU) (Italien) für die Bereitstellung klinischer Hundeproben sowie Dr. Giovanni Corbelli von der Abteilung für Infektionskrankheiten des Krankenhauses Marche Nord danken , Pesaro (Italien), für die Bereitstellung menschlicher klinischer Proben.

Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel des italienischen Gesundheitsministeriums (Fördernummer Ricerca Corrente 2021 IZS SI 04/21) und FANOATENEO unterstützt. Der Geldgeber spielte keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Interpretation der Daten oder dem Verfassen des Manuskripts.

Abteilung für Biomolekularwissenschaften, Universität Urbino Carlo Bo, Urbino, PU, ​​Italien

Gloria Buffi, Marcello Ceccarelli, Aurora Diotallevi, Michelalberto Abruzzese, Francesca Andreoni, Daniela Bencardino, Mauro Magnani und Luca Galluzzi

OIE-Leishmania-Referenzlabor, Nationales Referenzzentrum für Leishmaniose (C.Re.Na.L.), Experimentelles Zooprophylaktisches Institut von Sizilien, Palermo, PA, Italien

Federica Bruno, Germano Castelli und Fabrizio Vitale

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Konzeption und Design der Studie: MC, GB, FV, GC, FB und LG. Datenerfassung: GB, MC, MA, FA, DB und AD. Analyse und Interpretation der Daten: GB, MC, LG, AD und MM. Verfassen des Artikels: GB, MC, MA. Kritische Überarbeitung des Artikels auf wichtige intellektuelle Inhalte: LG, FV, GC, FB und MM. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Luca Galluzzi.

Die Verwendung von Bindehautabstrichen bei Hunden wurde am 31. Juli 2012 von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Urbino (CESA) genehmigt. Der Titel der Studie lautete „Biomolekulare Diagnose von Leishmaniose durch die Verwendung nicht-invasiver klinischer Proben und deren Verwendung für.“ therapeutisches Monitoring“ (Prot. CESA 2/2012).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Tabelle S1. Gene und Genomkoordinaten des MLST-Panels, das mit dem Ion AmpliSeq™-Designer unter Verwendung der L. infantum JPCM5-Genomassemblierung GCA_900180445 als Referenz erstellt wurde.

Abbildung S1. Sequenz des L. infantum MHOM/FR/78/LEM75 (DQ449701.1) ME-Gens und Primer, die für PCR-MEint und PCR-ME65 verwendet werden. PCR-MEint-Primer sind fett gedruckt, ME65-R-Primer sind unterstrichen. MEint-F ist für beide qPCR-Assays gleich. Die polymorphe Position (390T/G) ist eingerahmt.

Abbildung S2. Sequenz des L. infantum MHOM/FR/78/LEM75 (AJ620617.1) GPI-Gens und Primer, die für PCR-GPIext und PCR-GPI88 verwendet werden. PCR-GPIext-Primer sind unterstrichen, PCR-GPI88-Primer sind fett gedruckt. Die polymorphe Position (1831A/G) ist eingerahmt.

Abbildung S3. Spezifitätsbewertung der Primer GPIext-F/GPIext-R (a), MEint-F/ME65-R (b) und GPI88-F/GPI88-R (c). M, Marker 100-bp-DNA-Leiter; LEM75, MHOM/FR/78/LEM75; IPT1, MHOM/TN/80/IPT1; H, menschliche DNA; D, Hunde-DNA; C, Katzen-DNA; T, Trypanosoma cruzi-DNA; NTC, keine Vorlagensteuerung.

Abbildung S4. Elektropherogramme der klinischen Proben 2073U und 2604U, erhalten mit qPCR-MEint im Vergleich zu Referenzstämmen. Die Pfeile zeigen den diagnostischen SNP in Position 390.

Abbildung S5. Elektropherogramme ausgewählter Amplikons, erhalten mit dem qPCR-GPIext. Die Pfeile zeigen die Position 1831 an, an der ein diagnostischer SNP gefunden wurde. Insbesondere ist die Heterozygotie des Stammes MHOM/IT/93/ISS822 und des klinischen Isolats V2921 offensichtlich. Darüber hinaus zeigen die Elektropherogramme unterschiedliche Ergebnisse in linken und rechten Bindehautabstrichen der klinischen Probe Els-mai von Hunden. Els-maia, Abstrich der linken Bindehaut; Els-maib, rechter Bindehautabstrich.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Buffi, G., Ceccarelli, M., Diotallevi, A. et al. Hochauflösender Schmelz (HRM)-basierter Nachweis von Polymorphismen in den Genen Äpfelsäureenzym und Glucose-6-phosphat-Isomerase für die Genotypisierung von Leishmania infantum. Parasites Vectors 16, 282 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05878-y

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Eingegangen: 24. Februar 2023

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05878-y

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