Ein konserviertes Protein von Babesia microti bewirkt einen teilweisen Schutz gegen Babesia- und Plasmodium-Infektionen

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 306 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der einzellige Parasit Babesia microti, der die zoonotische Krankheit Babesiose verursacht, lebt während seines Lebenszyklus in den Erythrozyten seines Säugetierwirts. Derzeit sind keine wirksamen Impfstoffe zur Vorbeugung von Babesia microti-Infektionen verfügbar.

Wir haben zuvor durch Hochdurchsatz-Proteinchip-Screening ein hochseroaktives Antigen namens Bm8 als ein in B. microti konserviertes Erythrozytenmembran-assoziiertes Antigen identifiziert. Bioinformatische und phylogenetische Analysen zeigten, dass dieses membranassoziierte Protein bei apikomplexen Hämoprotozoen wie Mitgliedern der Gattungen Babesia, Plasmodium und Theileria konserviert ist. Wir haben das rekombinante Protein Bm8 (rBm8) durch prokaryotische Expression und Reinigung erhalten.

Immunfluoreszenztests bestätigten, dass Bm8 und sein Plasmodium-Homolog hauptsächlich im Zytoplasma des Parasiten lokalisiert waren. Das rBm8-Protein wurde spezifisch von den Seren von Mäusen erkannt, die mit B. microti oder P. berghei infiziert waren. Außerdem hatten mit Bm8-Polypeptid immunisierte Mäuse nach einer B. microti- oder P. berghei-Infektion eine verringerte Parasitenlast.

Eine passive Immunisierung mit Bm8-Antiseren könnte Mäuse bis zu einem gewissen Grad vor einer Infektion mit B. microti oder P. berghei schützen. Diese Ergebnisse führen uns zu der Hypothese, dass das in B. microti konservierte Erythrozytenmembran-assoziierte Protein Bm8 als neuartiger Breitspektrum-Parasitenimpfstoffkandidat dienen könnte, da es eine schützende Immunantwort gegen Babesiose- und Plasmodium-Infektionen hervorruft.

Parasiten der Gattung Babesia sind von Zecken übertragene intraerythrozytäre Protozoen, die zum Stamm Apicomplexa gehören. Babesiose hat sich zu einer zunehmenden Bedrohung der öffentlichen Gesundheit entwickelt und wurde in vielen Ländern zu einer landesweit meldepflichtigen Infektionskrankheit erklärt [1,2,3]. Die wichtigsten Babesia-Arten, von denen bekannt ist, dass sie Menschen infizieren und somit als zoonotische Krankheitserreger fungieren, sind B. microti, B. venatorum, B. canis und B. divergens [4, 5]. Das klinische Erscheinungsbild der Babesiose besteht überwiegend aus asymptomatischen oder milden Symptomen, schwerwiegendere klinische Symptome treten jedoch häufig bei Neugeborenen oder immungeschwächten Patienten auf. Darüber hinaus können Babesieninfektionen bei Splenektomiepatienten lebensbedrohlich sein [6, 7]. Plasmodium, eine weitere Gattung vektorübertragener Protozoenparasiten, stellt eine noch größere Bedrohung für die globale Gesundheit dar, da sie Malaria verursacht. Allein im Jahr 2021 wurden schätzungsweise 619.000 Todesfälle auf Malaria zurückgeführt [8]. Sowohl Plasmodium als auch Babesia sind apikomplexe Hämoprotozoen, die Erythrozyten des Wirts infizieren und sich darin vermehren können. Die durch Parasiteninvasion vermittelte Zytoadhärenz infizierter roter Blutkörperchen (RBCs) und die Invasion roter Blutkörperchen durch Parasiten sind zwei verschiedene und unabhängige Prozesse. Als erster Schritt bei der Erythrozyteninvasion heften sich die Merozoiten an die Membran der Erythrozyten [9, 10], ein Prozess, der stark von Wechselwirkungen zwischen dem Parasiten und Molekülen auf der Oberfläche der Wirtszelle abhängt [11,12,13]. Eine Reihe von Studien an Tiermodellen haben gezeigt, dass der Schutz einiger Proteine, die an der Zellinvasion und Immunität beteiligt sind, begrenzt ist; Daher ist bis heute kein Impfstoff gegen B. microti-Infektionen verfügbar und weitere Untersuchungen sind erforderlich [14,15,16,17,18,19]. Der RTS,S-Impfstoff, der weltweit erste und am weitesten entwickelte Malaria-Impfstoff, zeigte nur eine mäßige Wirksamkeit gegen Plasmodium falciparum bei relativ kurzer Lebensdauer [20].

Aktuelle Impfstoffentwicklungsbemühungen konzentrieren sich auf die Verwendung antigenisch definierter Immunogene, insbesondere solcher Moleküle, die mit den Erythrozyten des Wirts interagieren oder den Prozess der Parasiteninvasion stören [21]. In unserer vorherigen Proteom-Hochdurchsatz-Screening-Studie haben wir eine Reihe von B. microti-Proteinen mit hoher Antigenität identifiziert (19, 22). Der Schutz und das diagnostische Potenzial von Signalpeptiden aus diesen sekretierten Proteinen, einschließlich Protein 44 mit der Bezeichnung BmSP44, wurden bewertet [23]. In der vorliegenden Studie führte das Screening von Proteom-Hochdurchsatzchips und die Analyse mittels Bioinformatik zur Identifizierung des Erythrozytenmembran-assoziierten Proteins 8 von B. microti (genannt Bm8) als konserviertes Protein unter den Apicomplexan-Parasiten, wie z. B. Plasmodium spp. und Theileria spp. Nachdem wir das Protein geklont und exprimiert und eines seiner Peptidfragmente synthetisiert hatten, untersuchten wir den Immunschutz gegen murinen Plasmodium-Infektionen und Babesia-Infektionen. Das Ziel dieser Studie bestand darin, gängige Moleküle zu identifizieren, die als Referenz für die Prävention und Kontrolle von durch Vektoren übertragenen Hämoprotozoen verwendet werden können.

Weibliche BALB/C-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden vom Laboratory Animal Center der Universität Soochow bezogen und in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Umgebung aufgezogen. Der Stamm B. microti Peabody (ATCC: PRA-99) wurde ursprünglich von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) bezogen. Beide in dieser Studie verwendeten Parasiten, nämlich B. microti und Plasmodium berghei ANKA, wurden vom National Institute of Parasitic Diseases (NIPD), Chinese Center for Disease Control and Prevention (Peking, China), bereitgestellt. Zwei BALB/c-Mäuse in jeder Gruppe wurden durch intraperitoneale Injektion mit Parasiten von B. microti oder P. berghei infiziert. Blutproben aller infizierten Tiere wurden 5–7 Tage nach der Infektion (als die Parasitämie etwa 60 % betrug) aus den Augenlidern in EDTA-haltige Antikoagulansröhrchen entnommen. Das infizierte Blut wurde dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:4 gemischt und jeder BALB/c-Maus wurden 100 μl verdünntes Blut intraperitoneal injiziert (etwa 1 × 107 infizierte Parasiten in Erythrozyten [iRBCs]).

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der ethischen Verwendung von Tieren für medizinische Zwecke vom Gesundheitsministerium der Volksrepublik China durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Soochow für die Verwendung im Labor genehmigt Tiere (Genehmigungsnummer: ECSU-201800091).

Das Sequenz-Alignment des Ziel-Plasmodium-Erythrozytenmembran-assoziierten Gens aus Arten der Gattungen Babesia, Plasmodium und Theileria wurde mit dem MEGA-Version-X-Tool durchgeführt (24). Die phylogenetische Analyse wurde mit der Maximum-Likelihood- und Neighbor-Joining-Methode durchgeführt und die Baumtopologien wurden hinsichtlich einer robusten Phylogenie verglichen. Die Sequenz von B. microti (Zugangsnummer: XP_021338580.1), Babesia bovis (Zugangsnummer: XP_001610259.2), P. berghei (Zugangsnummer: XP_034420266.1), Plasmodium vivax (Zugangsnummer: SCO66108.1), Plasmodium falciparum (Zugangsnummer: XP_002585407.1) und Theileria annulata (Zugangsnummer: XP_952528.1) wurden online gesprengt [25]. Toxoplasma gondii (Zugangsnummer: 37589.1) wurde als Außengruppe ausgewählt und die Bootstrap-Werte wurden mit 1000 Pseudoreplikaten berechnet. Das SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive) wurde verwendet, um das dreidimensionale (3D) Strukturmodell basierend auf der Kristallstruktur des Plasmodium-Erythrozytenmembran-assoziierten Antigens zu erstellen, über das zuvor berichtet wurde.

Komplementäre DNA von B. microti wurde verwendet, um den offenen Leserahmen (ORF) von Bm8 zu verstärken. Der ORF voller Länge von Bm8 wurde unter Verwendung der BamHI- und Das Fusionsprotein, das den GST-Tag in Escherichia coli BL21 enthielt, wurde unter Verwendung eines Protokolls exprimiert, das dem in [23] beschriebenen ähnelt. Nach Abspaltung des GST-Tags mit Procession-Protease wurde das rekombinante Protein Bm8 (Bm8) erhalten und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot-Assay verifiziert.

Ein Enzymimmunoassay (ELISA) wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Kurz gesagt, Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 1 μg/ml (100 μl/Vertiefung) rBm8 in 0,1 M Bicarbonat-Beschichtungspuffer (pH 9,6) beschichtet und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Anschließend wurden die Platten dreimal mit 200 μl PBS plus 0,05 % Tween-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gewaschen, woraufhin die Vertiefungen 1 Stunde lang mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert wurden bei Raumtemperatur mit 100 μl Blockierungspuffer (PBS mit 0,05 % Tween-20 und 5 % fettfreier Milch). Gepoolte Seren von mit B. microti oder P. berghei infizierten Mäusen (6 Mäuse in jeder Gruppe; 14 Tage nach der Infektion gesammelte Seren; 100 μl) und eine äquivalente Menge negativer Mäuseseren (von gesunden Mäusen gesammelt) wurden mit 1 % BSA verdünnt (1:10, 1:100, 1:1000 und 1:10.000) gemischt und 2 Stunden lang inkubiert. Nach einstündiger Inkubation mit dem Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin G (IgG)-Antikörper wurde das TMB-Substrat (Ebioscience, Kalifornien, Amerika) für Meerrettich-Peroxidase-Mikrotiterplattenanwendungen hinzugefügt und 20 Minuten lang inkubiert, um die Reaktion nachzuweisen. Die Reaktion wurde mit 100 μl 1 M H2SO4 gestoppt. Die optische Dichte (OD) bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Modell ELX800; BioTek, Winooski, VT, USA) bestimmt. Die ELISA-Tests wurden für jedes infizierte Modell dreimal wiederholt.

Mäusen wurde Blut entnommen, wenn die Parasitämie etwa 70 % betrug. Als erster Schritt wurde das Blut mittels Cytospin-Zentrifugation (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) auf Objektträger ausgestrichen und 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd-PBS fixiert. Die isolierten Erythrozyten auf den Objektträgern wurden dann 15 Minuten lang mit 0,4 % Triton permeabilisiert und 30 Minuten lang mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) blockiert. Abschließend wurden die Objektträger mit 1:500 verdünntem Anti-Bm8-Serum über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach einstündiger Inkubation mit Alexa fluor 680 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, verdünnt 1:500, wurden 0,5 ug/ml DAPI zugegeben und 10 Minuten lang im Dunkeln gefärbt. Die Bildgebung wurde mit dem konfokalen Mikroskopiesystem Nikon C2+ (Nikon Corp., Tokio, Japan) durchgeführt.

Die Antikörperepitope von Bm8 wurden online anhand der Analyseressourcen der Immune Epitope Database (IEDB) vorhergesagt (http://tools.immuneepitope.org/bcell/). Die Antigenität von Bm8 wurde analysiert und die Zielpolypeptide (CYDPEKSNSAEW) wurden von Sangon Biotech (Shanghai, China) ausgewählt und chemisch synthetisiert. Die Kaninchen-Antiseren wurden durch Immunisierung des Kaninchens mit den synthetisierten Polypeptiden hergestellt.

Zur aktiven Immunisierung wurden fünf Mäuse in jeder Gruppe mit Bm8-Polypeptiden (20 μg/Maus), gemischt mit vollständigem Freund-Adjuvans, als subkutane Immunisierung nach dem Emulgieren immunisiert. Die Kontrollgruppe wurde nur mit der Mischung aus Freundschem Adjuvans und PBS immunisiert. Eine Auffrischimpfung (40 μg/Maus) wurde 2 Wochen nach der ersten Immunisierung durchgeführt, gefolgt von einer zweiten Auffrischimpfung (40 μg/Maus) 1 Woche danach. Das Serum wurde eine Woche nach der dritten Immunisierung gesammelt und die Antikörpertiter mittels ELISA gemessen. Wenn eine erfolgreiche aktive Immunisierung durch ELISA bestätigt wurde, wurden die Tiere eine Woche nach der letzten Auffrischungsimpfung mit einer intraperitonealen Infektion mit Erythrozyten, die 1 × 107 Parasiten von P. berghei oder B. microti enthielten, provoziert.

Zur passiven Immunisierung wurden fünf Mäuse in jeder Gruppe mit Bm8-Polypeptid-Antiseren, bereitgestellt von einem Unternehmen für synthetische Peptide, Sangon Biotech (Shanghai, China), (jeweils 200 μl) oder mit normalen Kaninchenseren immunisiert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere einer intraperitonealen Infektion mit Erythrozyten ausgesetzt, die 1 × 107 Parasiten von P. berghei oder B. microti enthielten. Zwei Tage später erhielten die Mäuse beider Gruppen eine Auffrischimpfung mit der gleichen Dosierung wie die Erstimmunisierung.

Die Konzentration von Parasiten im peripheren Blut von Mäusen wurde durch Blutausstrichuntersuchung und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) bestimmt. Alle 3 Tage nach der Infektion wurden Blutausstriche von der Schwanzspitze der Mäuse entnommen. Die Anzahl infizierter Erythrozyten in jedem Gesichtsfeld wurde durch Mittelung von 50 Gesichtsfeldzählungen unter einem Mikroskop nach Giemsa-Färbung berechnet. Der Grad der Infektion bei jeder Maus wurde als Prozentsatz der Parasitämie ausgedrückt. Gleichzeitig wurde RT-PCR zur Amplifikation von Messenger-RNA (mRNA) eingesetzt, um die Parasitenlast zu bestimmen. Kurz gesagt wurde das DNA/RNA Isolation Kit von Omega Bio-tek (Norcross, GA, USA) verwendet, um mRNA aus dem Blut infizierter Mäuse zu extrahieren. Die reverse Transkription wurde mit 5× All-In-One RT Mastermix (abm, Shanghai, China) durchgeführt. Die folgenden Primer wurden für den RT-qPCR-Assay verwendet: (i) B. microti 18S ribosomale RNA (rRNA) Vorwärts- (AGCGTTTTCGAAGGTATGTTGC) und Rückwärts-Primer (GCAGATACATCCTTACTAGGGAAA); (ii) P. berghei 18S-rRNA-Vorwärts- (AGCGTTTTCGAAGGTATGTTGC) und Rückwärts- (AGCAGATACATCCTTACTAGGGAAA) Primer; (iii) Maus-Beta-Actin (Kontrollgen) Vorwärts- (AGAGGGAAATCGTGCGTGAC) und Rückwärts-Primer (CAATAGTGATGACCTGGCCGT). Das qPCR-Protokoll bestand aus einer Vordenaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von einer Denaturierung für 10 Sekunden, einem Annealing bei 60 °C für 10 Sekunden und einer Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden.

Zusätzlich zur Messung der Parasitämie und der Parasitenbelastung durch Babesia oder Plasmodium wurden auch Gewicht, Temperatur und Hämoglobinspiegel (Hb) der Mäuse beurteilt, um den Schweregrad der Mäuse-Babesiose oder P. berghei-Infektionen zu beurteilen. Das Gewicht und die Analtemperatur wurden täglich nach einer Infektion mit B. microti oder P. berghei überwacht. Um die Konzentration von Hämoglobin (Hb) aus verschiedenen Gruppen zu messen, wurden 10 µl Blut in 2490 µl Drabkin-Reagenz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in jeder Probe verdünnt und bei 540 nm mit einem Biophotometer (Eppendorf) quantifiziert , Hamburg, Deutschland). Die Extinktion und die Hb-Konzentration wurden unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Hb-Standardkurve gezählt.

Die Daten wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) analysiert. Datenunterschiede zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen wurden mithilfe eines t-Tests bei unabhängigen Stichproben verglichen, wobei P < 0,05 das Kriterium für die statistische Signifikanz der Daten war.

Die kodierende Sequenz von Bm8 bestand aus 1545 Nukleotiden, was voraussichtlich ein Protein mit 515 Aminosäureresten produzieren würde (Zusatzdatei 1: Word-Datei S1). Das Protein hatte schätzungsweise ein Molekulargewicht von 56,65 kDa und einen isoelektrischen Punkt von 7,91. Der TMHMM-Server wurde verwendet, um eine Suche nach konservierten Domänen durchzuführen, was darauf hinweist, dass das Protein ein Homolog mit einer bekannten SCOP-Domänenstruktur an den Positionen 274–423 und zwei Transmembranregionen aufweist (referenziert von https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM). wie in Abb. 1a dargestellt. Das Alignment mehrerer Sequenzen durch ClustalW legte nahe, dass Bm8 eine Homologie mit Sequenzen der Apicomplexan-Protozoenparasiten P. berghei (GenBank: XP_034420266.1), Plasmodium falciparum (GenBank: XP002585407.1) und Plasmodium vivax (GenBank: SCO66108.1) aufweist (Abb. 1b). ). Die konservierte membranassoziierte Sequenz von Bm8 wurde mithilfe eines phylogenetischen Baums analysiert, um sie mit Homologen anderer apikomplexer Protozoenarten zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass Bm8 eine engere Beziehung zu Plasmodium spp. hat. und Theileria spp. Der KFG37589.1. Als Außengruppe wurde die konservierte membranassoziierte Protein-Aminosäuresequenz von Theileria gondii verwendet (Abb. 1C).

Bioinformatische Analyse des konservierten membranassoziierten Antigens Bm8. Eine Suche nach konservierten Domänen ergab, dass das Protein ein Homolog mit einer bekannten Struktur bei 274–423 hat; Zwei Transmembranregionen wurden vom TMHMM-Server (https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM) erkannt. Zahlen von 0 bis 500 geben die Länge der Proteinsequenz an. Die Transmembranregion ist blau dargestellt. b Mehrfachsequenz-Alignment der konservierten membranassoziierten Sequenzen von Babesia microti mit anderen apikomplexen Protozoen (Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Babesia bovis, Theileria annulata und Toxoplasma gondii) durch ClustalW. Der grüne Kasten zeigt die synthetischen konservativen Polypeptidregionen (dh alle Aminosäuren sind identisch); Gelb markierte Bereiche stellen unvollständig konservierte Proteinregionen dar (dh mindestens 4 der 6 Proben weisen identische Aminosäuren auf). Der grüne Kasten zeigt die konservierten Polypeptide von Babesia, Plasmodium, Theileria und Toxoplasma mit den in dieser Studie ausgewählten synthetisierten Peptiden von B. microti. c Phylogenetischer Baum der Sequenz der konservierten membranassoziierten Sequenzen mit anderen apikomplexen Protozoenarten. Der Maßstabsbalken stellt die Nukleotidsubstitutionen pro Position dar. Die Zweiglängen stellen das Ausmaß der genetischen Abstandsänderung zwischen den Stämmen dar. d Dreidimensionale Strukturmodelle des Erythrozytenmembran-assoziierten konservierten Proteins von Bm8, vorhergesagt durch das SWISS-MODEL-Programm. Die konservierten membranassoziierten Sequenzen anderer apikomplexer Protozoen (P. berghei, P. vivax, B. bovis und T. annulata) wurden gleichzeitig vorhergesagt. Die grünen Bereiche stellen die in dieser Studie verwendeten konservativen Polypeptide mit hoher Antigenwirkung dar. Bm8, B. microti-Protein 8

Um die Konservierung dieses membranassoziierten Antigens in den Apicomplexan-Parasiten weiter zu bestätigen, wurde die 3D-Struktur dieser Proteine vorhergesagt. Es wurde vorhergesagt, dass die vorhergesagte 3D-Struktur des konservierten membranassoziierten Antigens in Bm8 sieben α-Helices, 22 β-Stränge und 279 zufällige Locken enthält (Abb. 1d). Die Homologiemodellierung wurde mit den Homologieproteinen von B. microti, P. berghei und P. vivax durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass ihre vorhergesagten Domänenstrukturen gut konserviert sind. Der grün dargestellte Teil der 3D-Struktur von Bm8 (Abb. 1b) ist der Bereich mit vorhergesagter hoher Immunogenität und der Bereich der synthetisierten Polypeptide. Die Wirksamkeit des Immunschutzes wurde in dieser Studie bewertet und zeigte, dass die vorhergesagten Domänenstrukturen gut konserviert sind.

Um die Eigenschaften des konservierten membranassoziierten Proteins Bm8 zu untersuchen, haben wir ein rekombinantes Protein mit dem GST-Tag (ca. 24 kDa) generiert. Obwohl die Ausbeute an rBm8-Protein im E. coli-Expressionssystem relativ gering war, konnte das Protein erfolgreich gereinigt werden. Die vorhergesagte Größe von rBm8 betrug 57 kDa, was durch SDS-PAGE nach der Reinigung bestätigt wurde. Der Western-Blot-Assay wurde mit normalen Seren und mit Anti-B untersucht. Mikroti-Mäuse wurden jeweils 2 Wochen lang mit Seren infiziert. Die Ergebnisse des Western-Blot-Assays bestätigten nicht nur die Reinigung von rBm8, sondern auch die spezifische Antigenität von rBm8 (Zusatzdatei 2: Abbildung S1 A, B). Angesichts der geringen Ausbeute an rBm8 haben wir die Epitop-Polypeptide synthetisiert, um Mäuse zu immunisieren. Die vorhergesagten linearen Epitope von Bm8-Antigenen wurden in der Zusatzdatei 3 aufgeführt: Abbildung S2 A, B, C.

Um die Antigenität von rBm8 zu validieren, verwendeten wir einen indirekten ELISA, um rBm8-spezifische Antikörper aus den Seren von mit B. microti und P. berghei infizierten Mäusen nachzuweisen. Die Ergebnisse legen nahe, dass rBm8 durch die Seren erkannt werden könnte, die sowohl von B. microti- als auch von P. berghei-infizierten Mäusen gesammelt wurden (Abb. 2a). Alternativ könnten sowohl B. microti als auch P. berghei durch Anti-rBm8-Seren in den mit B. microti bzw. P. berghei infizierten RBCS nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Bm8 und sein Plasmodium-Homolog im Zytoplasma von B. microti und P. berghei lokalisiert sind. Als Negativkontrollen reagierten iRBCs von Mäusen, die mit B. microti oder P. berghei infiziert waren, nicht mit gepoolten Seren normaler Mäuse in den Kontrollgruppen (Abb. 2b, c).

Antigenität von rBm8 und seine subzelluläre Lokalisierung. a Bewertung der Antigenität durch ELISA mit gepoolten Seren von 5 Mäusen, die mit B. microti bzw. P. berghei infiziert waren. b Lokalisierung von Bm8 in iRBCs von B. microti, nachgewiesen durch IFA: i, ii iRBCs wurden mit Anti-rBm8-Seren co-inkubiert; iii Co-Inkubation von mit B. microti infizierten iRBCs mit gepoolten Seren normaler Mäuse als Kontrollgruppen. c Lokalisierung von Bm8 in iRBCs von P. berghei, nachgewiesen durch IFA: i, ii iRBCs wurden mit Anti-rBm8-Seren co-inkubiert; iii Co-Inkubation von mit P. berghei infizierten iRBCs mit gepoolten Seren normaler Mäuse als Kontrollgruppen. Maßstabsbalken: 5 μm. iRBCs, mit Parasiten infizierte rote Blutkörperchen; IFA, Immunfluoreszenztest; rBm8, rekombinantes B. microti-Protein 8

In diesem Teil unserer Studie haben wir untersucht, ob die aktive Immunisierung von Mäusen mit dem Bm8-Polypeptid die Babesia-Infektion beeinflusst. Nach aktiver Immunisierung wurde in den Seren von Mäusen ein hoher Anteil an Bm8-Antikörpern nachgewiesen (Zusatzdatei 4: Abbildung S3 A, B). Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren die Kopienzahlen des Babesia-Gens und das Parasitämieniveau der immunisierten Mäuse am Tag 9 nach der Infektion verringert (Abb. 3a, b). Darüber hinaus waren die Veränderungen des Hb-Spiegels, des Körpergewichts und der Analtemperatur, die den Schweregrad der Babesiose bei BALB/c-Mäusen widerspiegeln, zwischen der immunisierten Gruppe und der Kontrollgruppe vergleichbar. Obwohl die Parasitämie in der Immungruppe geringer war als in der Kontrollgruppe, gab es keinen signifikanten Unterschied bei den Indikatoren für die Schwere der Erkrankung, wie Hämoglobinkonzentration, Körpergewicht und Temperatur (Abb. 3c, i, ii, iii).

Eine aktive Immunisierung schützt vor einer B. microti-Infektion bei BALB/c-Mäusen, die durch das Bm8-Polypeptid induziert wird. a Nachweis der Kopienzahl des B. microti-Gens in BALB/c-Mäusen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion mittels qRT-PCR. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied bei **P < 0,01 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. b Parasitämie-Vergleich bei BALB/c-Mäusen, die an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der mikroskopisch nachgewiesenen Infektion mit B. microti infiziert waren. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei *P < 0,05 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. c Schweregrad der Babesiose bei Mäusen, die eine aktive Immunisierung mit Bm8-Polypeptid erhielten, im Vergleich zur Kontrollgruppe, an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion: i–iii Veränderungen des Hb-Spiegels (i), des Körpergewichts (ii) und der Körpertemperatur ( iii). Bm8, B. microti-Protein 8; Hb, Hämoglobin; mRNA, Messenger-RNA; qRT-PCR, quantitative Echtzeit-PCR

Als nächstes untersuchten wir, ob die aktive Immunisierung von Mäusen mit dem Bm8-Polypeptid die Plasmodium-Infektion beeinflusst. Die Kopienzahl des Plasmodium 18S-RNA-Gens am Tag 9 nach der Infektion war bei den immunisierten Mäusen niedriger als in der Kontrollgruppe (Abb. 4a, b). Die Analtemperatur war bei Mäusen in der immunisierten Gruppe am Tag 9 nach der P. berghei-Infektion höher als in der Kontrollgruppe (Abb. 4 c, iii). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Hb-Konzentration und im Körpergewicht (Abb. 4c, i, ii).

Vergleich der Körperindikatoren zwischen immunisierten Mäusen und mit P. berghei infizierten Kontrollmäusen nach aktiver Immunisierung mit Bm8-Polypeptid bzw. Adjuvans. a Nachweis der Kopienzahl des P. berghei-Gens in BALB/c-Mäusen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion durch qRT-PCR. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei *P < 0,05 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. b Parasitämie-Vergleich bei mit P. berghei infizierten BALB/c-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion, nachgewiesen durch Mikroskopie. c Schweregrad der Babesiose bei Mäusen, die eine aktive Immunisierung mit Bm8-Polypeptid erhalten, im Vergleich zur Kontrollgruppe: i–iii Veränderungen des Hb-Spiegels (i), des Körpergewichts (ii) und der Körpertemperatur (iii) bei BALB/c-Mäusen, die einer Infektion mit P. berghei ausgesetzt sind an den Tagen 3, 6 und 9 nach der Infektion. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei *P < 0,05 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. Bm8, B. microti-Protein 8; Hb, Hämoglobin; mRNA, Messenger-RNA; qRT-PCR, quantitative Echtzeit-PCR

Um die Schutzwirkung des Bm8-Antiserums gegen B. microti- und P. berghei-Infektionen zu untersuchen, wurde den Mäusen 24 Stunden vor der Belastung mit den Parasiten Bm8-Antiserum injiziert. Vier Tage nach der Infektion erfolgte eine Auffrischimpfung. Wir fanden heraus, dass die Kopienzahl des Babesia-Gens am Tag 3 nach der Infektion bei Mäusen, die mit B. microti infiziert waren, niedriger war als bei den Mäusen der Kontrollgruppe. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen der immunisierten Gruppe und der Kontrollgruppe (Abb. 5a, b). Die Hb-Konzentration an den Tagen 3 und 6 nach der Infektion war in der Immungruppe höher als in der Kontrollgruppe (Abb. 5c, i); Es gab keinen signifikanten Unterschied in Körpergewicht und Temperatur zwischen der Immungruppe und der Kontrollgruppe (Abb. 5c, ii, iii). Nach einer Infektion mit P. berghei waren die Kopienzahl des Plasmodium-Gens und die Parasitämie der immunisierten Mäuse am Tag 9 nach der Infektion niedriger als in der Kontrollgruppe. Auch hier gab es keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen der immunisierten Gruppe und der Kontrollgruppe (Abb. 6a, b). Die Analtemperatur der Mäuse in der immunisierten Gruppe war nach 9 Tagen Infektion mit P. berghei etwas höher als die der Kontrollgruppe. (Abb. 6c, iii); Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Hb-Konzentration und im Körpergewicht zwischen der Immungruppe und der Kontrollgruppe (Abb. 6c, i, ii).

Passive Immunisierung schützt vor einer B. microti-Infektion bei BALB/c-Mäusen, die durch Bm8-Antiseren induziert wird. a Nachweis der Kopienzahl des B. microti-Gens in BALB/c-Mäusen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion durch qRT-PCR. Das Sternchen zeigt eine Signifikanz bei *P ＜ 0,05 gegenüber der Kontrollserumgruppe (t-Test) an. b Parasitämie-Vergleich bei BALB/c-Mäusen, die an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion mit B. microti infiziert waren, mit der Kontrollgruppe, die durch Mikroskopie nachgewiesen wurde. c Schweregrad der Babesiose bei Mäusen bei Mäusen, die eine passive Immunisierung mit Bm8-Polypeptid-Antiseren erhielten, im Vergleich zu denen, die Kontrollseren erhielten: i–iii Veränderungen des Hb-Spiegels (i), des Körpergewichts (ii) und der Körpertemperatur (iii) bei BALB/c-Mäusen, die einer Infektion mit ausgesetzt waren B. microti an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zur Kontrollserumgruppe bei *P < 0,05 und **P < 0,01 (t-Test) an. Bm8, B. microti-Protein 8; Hb, Hämoglobin; qRT-PCR, quantitative Echtzeit-PCR; mRNA, Messenger-RNA; quantitative Echtzeit-PCR

Passive Immunisierung schützt vor einer durch Bm8-Antiseren induzierten P. berghei-Infektion bei BALB/c-Mäusen. a Nachweis der Kopienzahl des P. berghei-Gens in BALB/c-Mäusen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der Infektion durch qRT-PCR. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei *P < 0,05 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. b Parasitämie-Vergleich bei BALB/c-Mäusen, die an den Tagen 3, 6 und 9 nach der Infektion mit P. berghei infiziert waren, mit der Kontrollgruppe, die durch Mikroskopie nachgewiesen wurde. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei *P < 0,05 gegenüber der Adjuvansgruppe (t-Test) an. c Schweregrad der Babesiose bei Mäusen in der Mäusegruppe mit passiver Immunisierung mit Bm8-Polypeptid-Antiseren im Vergleich zu denen, die Kontrollseren erhielten: i, ii, iii Veränderungen des Hb-Spiegels (i), des Körpergewichts (ii) und der Körpertemperatur (iii) bei BALB/c-Mäusen Infektion mit P. berghei Tage 3, 6 und 9 nach der Infektion. a, b, c (i). Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied bei ***P < 0,001 (t-Test) an. Bm8, B. microti-Protein 8; Hb, Hämoglobin; qRT-PCR, quantitative Echtzeit-PCR; mRNA, Messenger-RNA; quantitative Echtzeit-PCR

Durch Vektoren übertragene Blutparasiten sind für einige der weltweit am weitesten verbreiteten, schwerwiegendsten und am wenigsten kontrollierten Krankheiten verantwortlich, darunter Malaria durch Plasmodium und Babesiose durch Babesia spp. Es besteht ein dringender Bedarf, die Übertragungsmechanismen und den Invasionsprozess dieser Parasiten in die Wirtszellen besser zu verstehen, um Kontrollmethoden, einschließlich der Entwicklung von Impfstoffen, zu optimieren [26]. In dieser Studie haben wir ein neues hochkonserviertes membranassoziiertes Antigen von B. microti, bekannt als Bm8, geklont und exprimiert und vorläufige funktionelle Untersuchungen durchgeführt, indem wir eines seiner Peptidfragmente synthetisiert haben. Basierend auf Strukturvorhersagen und Antigenitätsanalysen stellten wir fest, dass das Protein Bm8 eine hohe Homologie in den Apicomplexan-Protozoen aufwies, darunter P. berghei, P. vivax, P. falciparum, B. bovis und T. annulata. Darüber hinaus durchlaufen Mitglieder der Babesia- und Plasmodium-Gruppe, die zu denselben apikomplexen Hämoprotozoen gehören, einen komplexen Lebenszyklus, an dem Vektoren und Säugetierwirte beteiligt sind, und weisen einige ähnliche subzelluläre Strukturen auf. Diese beiden parasitären Protozoen können mehrere apikale Merozoitenmembran- und Organellenproteine absondern, die möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Invasion dieser Protozoen in Wirtszellen spielen [27, 28].

Interessanterweise wurde in einer Reihe veröffentlichter Studien festgestellt, dass Aspartylproteasen (APs) der Pepsinfamilie von B. microti eine phylogenetische Beziehung zu den Homologen der Plasmepsinen von P. falciparum (PfPM I–X) und T. gondii-Aspartylproteasen (TgASP1–7) aufweisen. . Basierend auf diesen Analogien mit plasmodialen Plasmepsinen wurde angenommen, dass die APs wertvolle Ziele für die Entwicklung artübergreifender Arzneimittel gegen Infektionen durch apikomplexe Protozoen darstellen [29,30,31]. Darüber hinaus wurde im Laufe der Jahre über eine Reihe von Fällen einer Mischinfektion mit Babesia und Plasmodium bei fieberhaften Patienten in Malaria-Endemiegebieten im Grenzgebiet zwischen China und Myanmar berichtet [32]. Weitere Fälle von Mischinfektionen wurden in der Kilosa-Region in Tansania, Afrika, Guinea in Westafrika und anderen Malaria-Endemiegebieten gemeldet [33,34,35]. Es wird allgemein angenommen, dass Babesien und Plasmodium, wenn sie einen Wirt gleichzeitig infizieren, miteinander interagieren und um die Invasion der Wirtszellen konkurrieren können [36, 37]. Die Autoren einer Studie berichteten, dass eine Reihe von aus China importierten Rhesusaffen eine geringe Parasitämie von Plasmodium aufwiesen, nachdem sie mit Infektionen in Berührung gekommen waren. Weitere Analysen ergaben, dass diese Rhesusaffen aus Guangxi, China, zuvor mit B. microti infiziert waren, was darauf hindeutet, dass diese zuvor mit Babesia infizierten Affen möglicherweise weniger empfindlich gegenüber Malaria sind oder dass das Fortschreiten der Malaria nach der Infektion langsamer ist als bei Kontrolltieren [ 36]. Das Vorhandensein von Koinfektionen mit durch Vektoren übertragenen Protozoen hat uns zu der Überlegung veranlasst, ob ein Impfstoff gegen mehrere ähnliche Protozoeninfektionen entwickelt werden kann. Angesichts der Wechselwirkungen zwischen Babesia- und Plasmodium-Parasiten und der Beobachtung, dass Erythrozytenmoleküle miteinander interagieren, könnten die gebildeten Liganden eine Rolle in der Parasitenschnittstelle spielen und eine erfolgreiche Invasion erleichtern [10, 37]. Mehrere konservierte Sequenzen unter den apikomplexen Protozoen und ihre damit verbundenen Invasions- und Konservierungsmechanismen legen nahe, dass diese Ziele während einer Koinfektion durch Babesia und Plasmodium Kreuzimmunreaktionen auslösen können (38, 39).

Obwohl durch Sequenzvergleich eine konservierte Region mit hoher Antigenität in Bm8 identifiziert wurde, gab es nur wenige verwandte Studien zu diesen Proteinen, die dieselbe konservative Sequenz enthielten. In der vorliegenden Studie wollten wir die potenzielle Schutzwirkung des Bm8-Polypeptids in einem Mausmodell untersuchen, das entweder mit B. microti oder P. berghei infiziert war. Basierend auf den Ergebnissen der aktiven Immunisierung war die Schutzwirkung des Bm8-Polypeptids im mittleren und späten Stadium der B. microti- und P. berghei-Infektionen deutlicher, insbesondere am Tag 9 nach der Infektion. Allerdings war die durch dieses Zielantigen induzierte Immunschutzwirkung relativ schwach, was möglicherweise mit der höheren Konzentration der Parasiten während der Challenge-Infektion und der niedrigeren Konzentration der in unserem Experiment verwendeten Antiseren zusammenhängt. In der Studie zur aktiven Immunisierung bei mit P. berghei infizierten Mäusen und der Kontrollgruppe zeigten die Ergebnisse der qPCR, dass am Tag 9 nach der Infektion die relative Kopienzahl der peripheren Blutparasiten in der immunisierten Gruppe niedriger war als in der Kontrollgruppe . In ähnlicher Weise zeigten die Ergebnisse der qPCR in der Studie zur passiven Immunisierung mit Bm8-Antiseren in B. microti-infizierten Gruppen und Kontrollgruppen, dass am Tag 3 nach der Infektion die relative Kopienzahl der Parasiten im peripheren Blut der immunisierten Mäuse betrug niedriger als im peripheren Blut der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse, die statistisch signifikante Unterschiede durch qPCR zeigen, stimmen nicht vollständig mit den Ergebnissen peripherer Blutausstriche im gleichen Zeitraum überein. Ein Grund könnte sein, dass qPCR eine empfindlichere Methode zum Nachweis von Wurmkonzentrationen ist, die biologisch aktiv sind oder sich in ihrem parasitären Lebenszyklus befinden (z. B. Parasiten, die in Erythrozyten eindringen), wohingegen der Nachweis von Parasitämie durch Blutausstriche intuitiver und konkreter ist relativ hinter der Infektion zurückbleiben. Ein weiterer Grund für die inkonsistenten Ergebnisse zwischen qPCR und Blutausstrich könnte im schwachen Immunschutz liegen, der durch die Zielpeptide und deren Antiseren hervorgerufen wird, sodass der Unterschied zwischen der Immungruppe und der Kontrollgruppe nicht signifikant ausreichend war. Ein weiteres nicht zu vernachlässigendes Problem besteht darin, dass die Klonierungs- und Expressionseffizienz des Zielproteins Bm8 gering war, was zu einer unzureichenden Proteinmenge in den Immunschutzexperimenten führte. Daher ist eine weitere Optimierung der experimentellen Methoden erforderlich, um die Funktion der konservativen Sequenz besser beurteilen zu können, und die Wirksamkeit von Bm8 als schützendes Antigen muss durch In-vivo- und In-vitro-Experimente überprüft werden.

Hb-Konzentration, Körpergewicht und Körpertemperatur sind Indikatoren, die die Schwere der Erkrankung widerspiegeln, und sie können deutlich unterschiedlich sein, wenn offensichtliche Schutzmaßnahmen in der Immungruppe induziert werden [23]. In dieser Studie stellten wir fest, dass die Hb-Konzentration in der Immungruppe an den Tagen 3 und 6 nach der passiven Immunität hinsichtlich einer Bm-Infektion signifikant höher war als in der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der offensichtlichen Verringerung des Parasitenspiegels und legt nahe, dass die passive Immunität des Anti-Bm8-Serums einen Schutz gegen Babesia-Infektionen hervorruft.

In der Kontrollgruppe der P. berghei-Infektionen waren die in den Abbildungen dargestellten Ergebnisse zu beobachten. 4c und 6c zeigen einen Vergleich der Körpertemperatur der Maus. Wir fanden heraus, dass die Körpertemperatur der immunisierten Gruppe höher war als die der Kontrollgruppe und näher an der normaler Mäuse lag. Wir spekulieren, dass der Grund dafür darin liegt, dass die infizierten Mäuse etwa 10 Tage nach der Infektion mit P. berghei kein Fieber mehr hatten, aber eine deutliche Verringerung der Erythrozyten aufwiesen, was möglicherweise auf eine schwere Anämie und eine allmählich sinkende Körpertemperatur zurückzuführen war bis hin zu extremer körperlicher Schwäche. Die Körpertemperatur lag näher an der der Normalgruppe, was möglicherweise darauf hindeutet, dass die Schwere der Erkrankung geringer ist als in der Kontrollgruppe.

Diese Studie weist eine Reihe von Einschränkungen auf. Obwohl IFA eine häufig verwendete Methode zur Markierung von Proteinen mit fluoreszierenden Antikörpern zur Lokalisierung ist (39, 40), konnten wir in dieser Studie das Zielprotein Bm8 nicht eindeutig lokalisieren. Es wurde vorhergesagt, dass es in diesem Protein zwei Transmembrandomänen gibt, die IFA zeigte jedoch keine Membranlokalisation, und dieser Aspekt bedarf einer weiteren Bewertung. Inzwischen spekulieren wir, dass Babesia spp. sind einzellige Eukaryoten mit Organellen. Daher können die auf der Membran lokalisierten Proteine auch Proteine auf der Plasmamembran der Organelle sein. Wenn weitere Experimente bestätigen, dass es sich bei Bm8 um ein Protein im Zytoplasma handelt, könnten mRNA-Impfstoffe vielversprechende Impfstoffe sein. mRNA kann durch die spezielle Abgabe von Genfragmenten (DNA oder RNA), die für das Bm8-Protein kodieren, direkt in tierische Körperzellen eingeführt werden (in den Menschen injizierter Impfstoff), wodurch über das Proteinsynthesesystem der Wirtszellen antigenes Protein produziert wird, um eine Immunantwort auf dieses Antigen auszulösen Protein zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten [41]. In der Literatur wurde auch gezeigt, dass Erythrozyten selbst als Träger für Systeme fungieren können, die Substanzen wie Medikamente, Enzyme, Peptide und Antigene in vivo abgeben; Wenn also klar ist, dass der Parasit nach der Invasion der Erythrozyten im Zytoplasma lokalisiert ist, hat dieser Mechanismus Auswirkungen auf die Entwicklung intrazytoplasmatischer Impfstoffe [42]. Zweitens wurde berichtet, dass eine Selbsteliminierung von Babesia-Protozoen möglich ist, insbesondere bei geringer Parasitämie. Dieses Phänomen wurde auch bei Infektionen durch eine Reihe von Babesia-Arten beschrieben [43]. Klinisch kann eine Infektion mit B. microti beim Menschen bei Vorliegen anderer Grunderkrankungen tödlich verlaufen, wobei die meisten Infektionen relativ harmlos verlaufen [4, 44]. Dieser Immun-Clearance-Mechanismus wird unweigerlich als Störfaktor in unserem Schutzbewertungsexperiment wirken. Wir verglichen die Infektion der Immungruppe und der Kontrollgruppe mit der gleichen Infektionsdosis zur gleichen Zeit. Drittens haben wir aufgrund der geringen Expression des Bm8-Proteins die konservierten antigenen Peptide synthetisiert, um die Immunschutzexperimente durchzuführen. Die Schutzstudien dieser Forschung verwendeten die synthetisierten Peptide und nicht das Bm8-Protein selbst. Wenn wir in der Zwischenzeit einige wichtige konservierte antigene Peptide identifizieren und Impfstoffe mithilfe synthetisierter Peptide entwickeln können, haben wir einen wirksamen Weg entwickelt, um die Komplexität der Proteinexpressions- und -reinigungsprozesse sowie die Ertragsunsicherheit zu überwinden. Schließlich sind weitere Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Zielprotein Bm8 und den Erythrozytenmembranrezeptoren erforderlich.

Unsere Studie identifizierte ein konserviertes erythrozytäres Membran-assoziiertes Protein aus B. microti mit dem Namen Bm8. Die Ergebnisse unserer Studie legen nahe, dass Bm8 ein vielversprechender Impfstoffkandidat für die Untereinheit sein könnte, der auf das Blutstadium von Hämoprotozoen abzielt, einschließlich Babesiose und durch Vektoren übertragene Plasmodium-Infektionen, basierend auf dem beobachteten Schutz sowohl in aktiven als auch passiven Immunisierungsstudien gegen B. microti und P. Berghei-Infektionen bei Mäusen. Da P. berghei außerdem als Modell für Malaria beim Menschen verwendet wird, könnten unsere Ergebnisse Auswirkungen auf die Entwicklung wirksamer Malaria-Impfstoffe haben. Insgesamt liefert diese Studie neue Erkenntnisse zur Prävention und Kontrolle intraerythrozytischer Protozoeninfektionen, die durch Vektoren übertragen werden.

Alle Daten sind als Zahlen und ergänzende Informationen im Artikel enthalten.

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Wir möchten Dr. Tingting Feng, Wen Pan und Zhen-yu Song für ihre technische Unterstützung danken.

Die Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81601784) und dem Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Key Laboratory of Parasite and Vector Biology des Gesundheitsministeriums mit der Fördernummer WSBKFKT-201710 unterstützt.

Yao Wang und Qianqian Zhang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Fakultät für Biologie und medizinische Grundlagenwissenschaften, Soochow-Universität, No.199 Renai Road, Suzhou, 215123, Volksrepublik China

Yao Wang, Wanruo Zhang und Xia Zhou

Institute of Biology and Medical Sciences, Jiangsu Key Laboratory of Infection and Immunity, Soochow University, No.199 Renai Road, Suzhou, 215123, Volksrepublik China

Qianqian Zhang & Jianfeng Dai

Nationales Institut für Parasitenkrankheiten, Chinesisches Zentrum für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (Chinesisches Zentrum für Tropenkrankheitsforschung), Schlüssellabor für Parasiten- und Vektorbiologie, Nationale Gesundheitskommission der Volksrepublik China (NHC), Weltgesundheitsorganisation (WHO) in Zusammenarbeit Zentrum für Tropenkrankheiten, Nationales Zentrum für internationale Forschung zu Tropenkrankheiten, Shanghai, 200025, China

Junhu Chen

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XZ und JD konzipierten die Studie, sammelten und analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. YW, QQZ und WRZ führten das gesamte Experiment durch und überarbeiteten das Manuskript. JHC konzipierte das Projekt und leistete technische Unterstützung bei der Datenerfassung und -analyse. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jianfeng Dai oder Xia Zhou.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der ethischen Verwendung von Tieren für medizinische Labore des Gesundheitsministeriums der Volksrepublik China durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Soochow für die Verwendung von Labortieren genehmigt ( Genehmigungsnummer: ECSU-201800091). Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Alle Autoren stimmten der Veröffentlichung des Artikels zu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Aminosäuresequenz des Zielproteins Bm8 (online als „konserviertes Plasmodium-Protein, unbekannte Funktion“ vermerkt).

Expression und Reinigung von rBm8. Eine durch SDS-PAGE-Elektrophorese bestätigte Reinigung von rBm8 durch Beladung mit rBm8 ohne GST-Tag mit einem Molekulargewicht von etwa 57 KDa. B Western-Blot-Assay des gereinigten rBm8: a sondiert mit normalem Mausserum, b sondiert mit Anti-B. Microti-Mäuseserum. Der rote Pfeil zeigt die Position der Bm8-Bande des Zielproteins an.

Abbildung S2: Vorhersage des linearen Epitops des Bm8-Antigens und Synthese des Zielpeptids (CYDPEKSNSAEW). Eine Antigenanalyse von Bm8 mit fünf vorhergesagten Hauptantigenen. B Synthesebericht des Zielpeptids. C Herstellung eines Kaninchen-Antiserums des Zielpeptids.

Abbildung S3: Bewertung der aktiven Immunitätsbeeinträchtigung. In jeder Gruppe wurden 5 Mäuse zum Aufbau der aktiven Immunisierungsmodelle verwendet. Die Kontrollgruppe wurde mit einem äquivalenten Adjuvans immunisiert. A Bestimmung des aktiven Immunantikörpertiters des Bm8-Polypeptids (vor der Provokationsinfektion mit B. microti). B Bestimmung des aktiven Immunantikörpertiters des Bm8-Polypeptids (vor der Provokationsinfektion mit P. berghei).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, Y., Zhang, Q., Zhang, W. et al. Ein konserviertes Protein von Babesia microti bewirkt einen teilweisen Schutz gegen Babesia- und Plasmodium-Infektionen. Parasites Vectors 16, 306 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05825-x

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Eingegangen: 02. März 2023

Angenommen: 28. Mai 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05825-x

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